Questo protocollo descrive come preparare larve di Drosophila per analisi metabolomica basati su GC-MS.
I recenti progressi nel campo della metabolomica hanno stabilito il moscerino della frutta Drosophila melanogaster come un potente modello genetico per studiare il metabolismo degli animali. Combinando la vasta gamma di strumenti genetici della drosofila con la capacità di indagine vaste aree del metabolismo intermedio, un approccio di metabolomica può rivelare interazioni complesse tra dieta, genotipo, eventi di vita-storia e stimoli ambientali. Inoltre, studi di metabolomica possono scoprire nuovi meccanismi enzimatici e scoprire connessioni precedentemente sconosciute tra vie metaboliche apparentemente disparate. Al fine di facilitare l’uso più diffuso di questa tecnologia tra la comunità di Drosophila , qui forniamo un protocollo dettagliato che descrive come preparare campioni larvali della drosofila per spettrometria della cromatografia-massa del gas (GC-MS)- Basato su analisi metabolomica. Il nostro protocollo include descrizioni di campionario larvale, metabolita estrazione, derivatizzazione chimica e analisi GC-MS. Completamento del presente protocollo consentirà agli utenti di misurare l’abbondanza relativa di piccoli metaboliti polari, tra cui amminoacidi, zuccheri e acidi organici coinvolti nella glicolisi e i cicli TCA.
Moscerino della frutta Drosophila melanogaster è emerso come un sistema ideale per studiare i meccanismi molecolari che regolano il metabolismo intermedio. Non solo sono la maggior parte delle vie metaboliche conservate tra Drosophila e gli esseri umani, ma nutrienti chiave sensori e regolatori di crescita, come l’insulina, Tor e myc, sono anche attivi in volare1,2. Di conseguenza, Drosophila consente di esplorare la base metabolica delle malattie umane che vanno dal diabete e obesità a neurodegenerazione e cancro. A questo proposito, lo sviluppo larvale della drosofila fornisce il quadro ideale in cui studiare un programma metabolico conosciuto come glicolisi aerobica, o l’effetto di Warburg. Proprio come molti tumori utilizzano la glicolisi aerobica per generare biomassa da carboidrati, così per fare della drosofila larve attivano glicolisi aerobica per promuovere la crescita dello sviluppo3,4,5. Queste somiglianze tra larvale e metabolismo del tumore stabilire Drosophila come modello chiave per la comprensione come aerobico glicolisi è regolamentato in vivo.
Nonostante il fatto che la Mosca è emerso come un modello popolare per studiare il metabolismo, la maggior parte degli studi di Drosophila si basano su metodi che sono progettati per misurare diversi metaboliti3, quali trealosio, trigliceridi o ATP. Poiché un protocollo specifico è necessaria per misurare ogni metabolita, studi basati su analisi sono laboriosi, costoso e prevenuto verso quei composti che possono essere misurati usando i kit commerciali. Una soluzione a queste limitazioni è emerso dal campo della metabolomica, che fornisce un mezzo più efficiente ed imparziale di studiare il metabolismo di Drosophila . A differenza di uno studio basato su analisi, un’analisi metabolomica singolo può simultaneamente misurare centinaia di piccole molecole metaboliti e fornire una comprensione globale di stato metabolico6,7 di un organismo. Questa tecnica ha notevolmente ampliato il campo di studi metabolici di Drosophila e rappresenta il futuro di questo settore emergente8.
Metabolomica studi vengono condotti principalmente utilizzando tre tecnologie: (i) risonanza magnetica nucleare (NMR), (ii) liquida spettrometria della cromatografia-massa (LC-MS) e (iii) gas cromatografia-spettrometria (GC-MS)9. Ogni approccio offre vantaggi e svantaggi, e tutte queste tecnologie sono state usate per studiare con successo metabolismo di Drosophila . Poiché le ricerche condotte nel nostro laboratorio sono focalizzata sui metaboliti polari, piccoli, principalmente ci avvaliamo di un metodo basato su GC-MS. GC-MS fornisce all’utente una serie di vantaggi, tra cui alta riproducibilità, risoluzione dei picchi, sensibilità, e la disponibilità di una libreria spettrale di impatto (EI) standard dell’elettrone, che permette la rapida identificazione di scoperto metabolica caratteristiche10,11. La preparazione dei campioni per GC-MS, tuttavia, è piuttosto complessa e richiede una grande attenzione al dettaglio. Campioni devono essere raccolto, lavati, pesati e congelati in un modo che disseta rapidamente reazioni metaboliche. Inoltre, la carcassa Vola è resistente ai protocolli standard omogeneizzazione e richiede un mulino di tallone per assicurare l’estrazione ottimale del metabolita. Infine, i campioni analizzati mediante GC-MS devono subire derivatizzazione chimica prima del rilevamento12. Mentre precedentemente pubblicati metodi descrivono tutti questi passaggi3,13,14, è ancora necessario un protocollo visual che consentirebbe l’utente inesperto di riproducibile generare dati di alta qualità. Qui dimostriamo come preparare Drosophila larvali campioni per l’analisi metabolomica basati su GC-MS. Questo protocollo permette all’utente di misurare riproducibile molti dei piccoli metaboliti polari che compongono il metabolismo del carbonio centrale.
Metabolomica fornisce un’opportunità senza precedenti per sorvegliare le reazioni metaboliche che compongono il metabolismo intermedio. La sensibilità di questa tecnologia, tuttavia, rende i dati suscettibili di background genetico, stecche inerente allo sviluppo e una varietà di stress ambientali, tra cui temperatura, umidità, densità della popolazione e disponibilità di nutrienti. Di conseguenza, un’alta qualità e riproducibili metabolomica analisi richiedono che i campioni raccolti in condizioni altamente contr…
The authors have nothing to disclose.
Grazie ai membri dell’impianto di spettroscopia massa di Indiana University e la University of Utah metabolomica Core Facility per assistenza nell’ottimizzazione di questo protocollo. J.M.T. è supportato dal National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health, sotto Premio numero R35GM119557.
Unsulfured blackstrap molasses | Good Food, INC | ||
Drosophila Agar Type II | Genesee Scientific | 66-103 | |
Pyridine | EMD Millipore | PX2012-7 | |
Methoxyamine hydrocholoride (MOX) | MP Biomedicals, LLC | 155405 | |
MSTFA with 1% trimethylchlorosilane | Sigma | 69478 | |
Fleischmann’s Active dry yeast | AB Mauri Food Inc | 2192 | |
6oz Drosophila stock bottle | Genesee Scientific | 32-130 | |
Soft tissue homogenizing mix (2 mL tubes) | Omni International | SKU:19-627 | |
Vial insert, 250 µL deactivated glass with polymer feet | Agilent | 5181-8872 | |
Succinic acid-2,2,3,3-d4 | Sigma | 293075 | |
SpeedVac | Thermo | SC210A | |
o-Phosphoric acid | Fisher Scientific | A242-1 | |
Propionic acid | Sigma | P5561 | |
p-Hydroxy benzoic acid methyl ester | Genesee Scientific | 20-258 | |
Bead Ruptor | Omni International | SKU:19-040E | |
ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000012 | |
MultiTherm Shaker with a 24 X 12 mm block | Benchmark Scientific | H5000 | |
Methanol | Sigma | 34860 | |
1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 22364111 | |
Falcon 35 X 10 mm tissue culture dish | Corning Incorporated | 353001 | |
GC column | Phenomex | ZB-5MSi |