Summary

Vorbereitung von Drosophila Larven Proben für Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS)-basierte Metabolomik

Published: June 06, 2018
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Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Drosophila Larven für GC-MS-basierte Metabolomic Analyse vorzubereiten.

Abstract

Die jüngsten Fortschritte auf dem Gebiet der Metabolomik haben der Taufliege Drosophila Melanogaster als ein leistungsfähiges genetischen Modell für tierischen Stoffwechsel etabliert. Durch die Kombination von der Vielzahl der Drosophila genetische Werkzeuge mit der Fähigkeit, große Schwaden des intermediären Stoffwechsels Umfrage, kann ein Metabolomik Ansatz komplexe Wechselwirkungen zwischen Ernährung, Genotyp, Lebensgeschichte Veranstaltungen und ökologische Hinweise offenbaren. Darüber hinaus können Metabolomik Studien entdecken Sie neuartige enzymatische Mechanismen und bisher unbekannte Verbindungen zwischen scheinbar disparaten Stoffwechselwege zu entdecken. Um eine breitere Nutzung dieser Technologie unter den Drosophila -Community zu erleichtern, bieten wir hier ein detailliertes Protokoll, der beschreibt, wie Drosophila Larven Proben für Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) vorbereiten- Metabolomic Analyse basiert. Unser Protokoll enthält Beschreibungen der Larven Musterkollektion, Metabolit Extraktion, chemische Derivatisierung und GC-MS-Analyse. Erfolgreichen Abschluss dieses Protokolls ermöglicht es Benutzern, die relative Häufigkeit von kleinen polaren Metaboliten, darunter Aminosäuren, Zucker und organischen Säuren beteiligt in Glykolyse und der TCA-Zyklen zu messen.

Introduction

Die Fruchtfliege Drosophila Melanogaster ist entstanden, als ein ideales System für das Studium des molekularen Mechanismus, der intermediären Stoffwechsel regulieren. Nicht nur sind die meisten Stoffwechselwege konserviert zwischen Mensch und Drosophila , aber wichtigen Nährstoff Sensoren und Wachstumsregulatoren, wie Insulin, Tor und Myc, sind auch aktiv in die Fliege1,2. Drosophila ist dadurch lässt sich die metabolische Grundlagen menschlicher Erkrankungen, Diabetes und Adipositas bis hin zu Neurodegeneration und Krebs zu erforschen. In diesem Zusammenhang bietet Drosophila Larvalentwicklung den idealen Rahmen, um eine metabolische Studiengang als aerobe Glykolyse oder der Warburg-Effekt bekannt. So wie viele Tumoren aerobe Glykolyse Biomasse aus Kohlenhydraten zu generieren, aktivieren Sie also dazu Drosophila Larven aerobe Glykolyse zur Förderung der entwicklungspolitischen Wachstum3,4,5. Diese Ähnlichkeiten zwischen Larven und Tumor-Stoffwechsel Drosophila als ein Modell für das Verständnis wie aerobe etablieren Glykolyse ist geregelt in Vivo.

Trotz der Tatsache, die die Fliege als ein beliebtes Modell für Stoffwechsel entstanden ist, setzen die meisten Drosophila Studien auf Methoden, die entworfen sind, um die einzelnen Metaboliten3, wie Trehalose, Triglyceride oder ATP zu messen. Da ein bestimmtes Protokoll erforderlich ist, um jede Metaboliten zu messen, sind Assay-basierten Studien arbeitsintensiv, teuer und voreingenommen gegenüber dieser Verbindungen, die mit kommerziellen Kits gemessen werden kann. Eine Lösung für diese Einschränkungen entstanden aus dem Bereich der Metabolomik, sorgt für eine effizientere und unvoreingenommene Mittel der Drosophila Stoffwechsel. Im Gegensatz zu einem Assay-basierten Studie kann eine einzelne Metabolomic Analyse gleichzeitig Hunderte von niedermolekularer Metaboliten zu messen und bieten ein umfassendes Verständnis von einem Organismus Stoffwechsellage6,7. Diese Technik hat die Drosophila metabolische Studien deutlich erweitert und repräsentiert die Zukunft dieser aufstrebenden Feld8.

Metabolomic sind in erster Linie Studien mit drei Technologien: (i) Kernspinresonanz (NMR), (Ii) flüssige Gaschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) und (Iii) Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS)9. Jeder Ansatz bietet deutliche Vorteile und Nachteile, und alle diese Technologien wurden verwendet, um erfolgreich studieren Drosophila Stoffwechsel. Da die Forschung in unserem Labor auf kleine, polaren Metaboliten gerichtet ist, beschäftigen wir in erster Linie eine GC-MS-basierte Methode. GC-MS bietet dem Anwender eine Reihe von Vorteilen, einschließlich hohe Reproduzierbarkeit, Peak Auflösung, Empfindlichkeit, und die Verfügbarkeit einer standard Elektron Auswirkungen (EI) spektrale Bibliothek, ermöglicht eine schnelle Bestimmung entdeckt metabolische Funktionen10,11. Die Vorbereitung der Proben für GC-MS, jedoch ist etwas komplex und erfordert eine sorgfältige Aufmerksamkeit zum Detail. Proben müssen gesammelt, gewaschen, gewogen und in einer Weise, die schnell Stoffwechselreaktionen stillt eingefroren. Darüber hinaus fliegende Karkasse ist resistent gegen standard Homogenisierung Protokolle und erfordert eine Rührwerksmühle um optimale Metabolit Extraktion zu gewährleisten. Zu guter Letzt müssen Proben von GC-MS analysiert chemische Derivatisierung vor Erkennung12unterzogen werden. Während zuvor veröffentlichte Methoden alle diese Schritte3,13,14 beschreiben, ist eine visuelle Protokoll, die den unerfahrenen Benutzer reproduzierbar hochwertige Daten generieren lassen würde noch benötigt. Hier zeigen wir wie Drosophila Larven Proben für Metabolomik GC-MS-basierte Analyse vorzubereiten. Dieses Protokoll ermöglicht dem Benutzer, reproduzierbar Messen viele der kleinen polaren Metaboliten, die zentralen Kohlenstoff-Stoffwechsel zu komponieren.

Protocol

1. die Eizellentnahme Ausgewachsene Männchen und jungfräulichen Weibchen der gewünschten Genotypen zu sammeln. Individuell Alter dieser Tiere in einer Lebensmittel Durchstechflasche mit Bloomington Standardmedien für 3 – 5 Tage. Die entsprechenden Paarungen durch die Übertragung von 50 jungfräulichen Frauen und 25 Männer zu einem neuen Lebensmittel-Fläschchen eingerichtet.Hinweis: Ein Minimum von sechs unabhängigen Verpaarungen sollten für jeden Genotyp eingerichtet werden. Nur eine Pr…

Representative Results

Laktat-Dehydrogenase (dLDH) Mutanten, die dLDH Aktivität4und genetisch passenden Steuerelemente fehlen wurden als Mitte-L2 Larven gesammelt und nach oben beschriebenen Protokoll verarbeitet. Im Vergleich zu Kontrollen zeigen mutierte Larven signifikante Veränderungen in Laktat, Pyruvat und L-2-Hydroxyglutarate-4. Spektren wurden mit einem Agilent GC6890-5973i MS-System erworben. Ein Beispiel für die GC-MS Spektren erzeugen mit un…

Discussion

Metabolomik bietet eine einmalige Gelegenheit die Stoffwechselreaktionen vermessen, die intermediären Stoffwechsel zu komponieren. Die Empfindlichkeit dieser Technologie macht jedoch Daten anfällig für genetische Hintergrund, Entwicklungsstörungen Cues und eine Vielzahl von Umweltbelastungen, einschließlich Temperatur, Luftfeuchtigkeit, Bevölkerungsdichte und nährstoffverfügbarkeit. Daher eine hohe Qualität und reproduzierbare Metabolomik Analyse erfordert, dass Proben unter sehr kontrollierten Bedingungen gesam…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vielen Dank an die Indiana University Masse Spektroskopie Anlage und der University of Utah Metabolomik Core Facility für die Unterstützung bei der Optimierung dieses Protokolls. J.M.T. wird durch das National Institute of General Medical Sciences von den National Institutes of Health unter Preis Anzahl R35GM119557 unterstützt.

Materials

Unsulfured blackstrap molasses Good Food, INC
Drosophila Agar Type II Genesee Scientific 66-103
Pyridine EMD Millipore PX2012-7
Methoxyamine hydrocholoride (MOX) MP Biomedicals, LLC 155405
MSTFA with 1% trimethylchlorosilane Sigma 69478
Fleischmann’s Active dry yeast AB Mauri Food Inc 2192
6oz Drosophila stock bottle Genesee Scientific 32-130
Soft tissue homogenizing mix (2 mL tubes)  Omni International SKU:19-627
Vial insert, 250 µL deactivated glass with polymer feet Agilent 5181-8872
Succinic acid-2,2,3,3-d4 Sigma 293075
SpeedVac Thermo  SC210A
o-Phosphoric acid Fisher Scientific A242-1
Propionic acid Sigma P5561
p-Hydroxy benzoic acid methyl ester Genesee Scientific 20-258
Bead Ruptor Omni International SKU:19-040E
ThermoMixer F1.5 Eppendorf 5384000012
MultiTherm Shaker with a 24 X 12 mm block Benchmark Scientific H5000
Methanol Sigma 34860
1.5 mL centrifuge tube Eppendorf 22364111
Falcon 35 X 10 mm tissue culture dish Corning Incorporated 353001
GC column Phenomex ZB-5MSi

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Li, H., Tennessen, J. M. Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)-based Metabolomics. J. Vis. Exp. (136), e57847, doi:10.3791/57847 (2018).

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