Vorbereitung von Drosophila Larven Proben für Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS)-basierte Metabolomik

Die Fruchtfliege Drosophila Melanogaster ist entstanden, als ein ideales System für das Studium des molekularen Mechanismus, der intermediären Stoffwechsel regulieren. Nicht nur sind die meisten Stoffwechselwege konserviert zwischen Mensch und Drosophila , aber wichtigen Nährstoff Sensoren und Wachstumsregulatoren, wie Insulin, Tor und Myc, sind auch aktiv in die Fliege^1,2. Drosophila ist dadurch lässt sich die metabolische Grundlagen menschlicher Erkrankungen, Diabetes und Adipositas bis hin zu Neurodegeneration und Krebs zu erforschen. In diesem Zusammenhang bietet Drosophila Larvalentwicklung den idealen Rahmen, um eine metabolische Studiengang als aerobe Glykolyse oder der Warburg-Effekt bekannt. So wie viele Tumoren aerobe Glykolyse Biomasse aus Kohlenhydraten zu generieren, aktivieren Sie also dazu Drosophila Larven aerobe Glykolyse zur Förderung der entwicklungspolitischen Wachstum^3,4,5. Diese Ähnlichkeiten zwischen Larven und Tumor-Stoffwechsel Drosophila als ein Modell für das Verständnis wie aerobe etablieren Glykolyse ist geregelt in Vivo.

Trotz der Tatsache, die die Fliege als ein beliebtes Modell für Stoffwechsel entstanden ist, setzen die meisten Drosophila Studien auf Methoden, die entworfen sind, um die einzelnen Metaboliten³, wie Trehalose, Triglyceride oder ATP zu messen. Da ein bestimmtes Protokoll erforderlich ist, um jede Metaboliten zu messen, sind Assay-basierten Studien arbeitsintensiv, teuer und voreingenommen gegenüber dieser Verbindungen, die mit kommerziellen Kits gemessen werden kann. Eine Lösung für diese Einschränkungen entstanden aus dem Bereich der Metabolomik, sorgt für eine effizientere und unvoreingenommene Mittel der Drosophila Stoffwechsel. Im Gegensatz zu einem Assay-basierten Studie kann eine einzelne Metabolomic Analyse gleichzeitig Hunderte von niedermolekularer Metaboliten zu messen und bieten ein umfassendes Verständnis von einem Organismus Stoffwechsellage^6,7. Diese Technik hat die Drosophila metabolische Studien deutlich erweitert und repräsentiert die Zukunft dieser aufstrebenden Feld⁸.

Metabolomic sind in erster Linie Studien mit drei Technologien: (i) Kernspinresonanz (NMR), (Ii) flüssige Gaschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) und (Iii) Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS)⁹. Jeder Ansatz bietet deutliche Vorteile und Nachteile, und alle diese Technologien wurden verwendet, um erfolgreich studieren Drosophila Stoffwechsel. Da die Forschung in unserem Labor auf kleine, polaren Metaboliten gerichtet ist, beschäftigen wir in erster Linie eine GC-MS-basierte Methode. GC-MS bietet dem Anwender eine Reihe von Vorteilen, einschließlich hohe Reproduzierbarkeit, Peak Auflösung, Empfindlichkeit, und die Verfügbarkeit einer standard Elektron Auswirkungen (EI) spektrale Bibliothek, ermöglicht eine schnelle Bestimmung entdeckt metabolische Funktionen^10,11. Die Vorbereitung der Proben für GC-MS, jedoch ist etwas komplex und erfordert eine sorgfältige Aufmerksamkeit zum Detail. Proben müssen gesammelt, gewaschen, gewogen und in einer Weise, die schnell Stoffwechselreaktionen stillt eingefroren. Darüber hinaus fliegende Karkasse ist resistent gegen standard Homogenisierung Protokolle und erfordert eine Rührwerksmühle um optimale Metabolit Extraktion zu gewährleisten. Zu guter Letzt müssen Proben von GC-MS analysiert chemische Derivatisierung vor Erkennung¹²unterzogen werden. Während zuvor veröffentlichte Methoden alle diese Schritte^{3,13,14 beschreiben}, ist eine visuelle Protokoll, die den unerfahrenen Benutzer reproduzierbar hochwertige Daten generieren lassen würde noch benötigt. Hier zeigen wir wie Drosophila Larven Proben für Metabolomik GC-MS-basierte Analyse vorzubereiten. Dieses Protokoll ermöglicht dem Benutzer, reproduzierbar Messen viele der kleinen polaren Metaboliten, die zentralen Kohlenstoff-Stoffwechsel zu komponieren.