Este protocolo descreve como preparar larvas de Drosophila para análise da metabolómica baseados em GC-MS.
Recentes avanços no campo da metabolómica estabeleceram a mosca de fruta Drosophila melanogaster como um poderoso modelo genético para estudar o metabolismo animal. Combinando a vasta gama de ferramentas genéticas drosófila com a capacidade de levantamento de grandes áreas de metabolismo intermediário, uma abordagem metabolomics pode revelar interações complexas entre dieta, genótipo, eventos de vida-história e Dicas ambientais. Além disso, estudos metabolomics podem descobrir novos mecanismos enzimáticos e descobrir conexões anteriormente desconhecidas entre vias metabólicas aparentemente díspares. Para facilitar o uso mais difundido dessa tecnologia entre a comunidade de Drosophila , aqui nós fornecemos um protocolo detalhado que descreve como preparar amostras de larvas de Drosophila para cromatografia gasosa / espectrometria de massa (GC-MS)- com base em análise da metabolómica. Nosso protocolo inclui descrições de coleta de amostra larval, extração do metabólito, derivatização química e análise por CG-em. Conclusão bem-sucedida do presente protocolo permitirá que os usuários medir a abundância relativa dos metabólitos polares pequenas, incluindo aminoácidos, açúcares e ácidos orgânicos envolvidos na glicólise e os ciclos TCA.
Mosca da fruta Drosophila melanogaster emergiu como um sistema ideal para estudar o mecanismo molecular que regulam o metabolismo intermediário. Não só são a maioria das vias metabólicas conservadas entre Drosophila e seres humanos, mas chaves sensores de nutrientes e reguladores de crescimento, tais como a insulina, Tor e myc, também são ativos na mosca1,2. Como resultado, a Drosophila pode ser usado para explorar a base metabólica de doenças humanas que variam de diabetes e obesidade a neurodegeneração e câncer. A este respeito, desenvolvimento larval de Drosophila fornece o quadro ideal para se estudar um programa metabólico conhecido como glicólise aeróbica, ou o efeito de Warburg. Assim como muitos tumores glicólise aeróbica para gerar biomassa de hidratos de carbono, então, para fazer a drosófila larvas ativam glicólise aeróbica para promover o crescimento do desenvolvimento3,4,5. Essas semelhanças entre larval e metabolismo de tumor estabelecer drosófila como um modelo de chave para compreensão como aeróbio glicólise é regulamentado na vivo.
Apesar do fato que a mosca tem emergido como um modelo popular para estudar o metabolismo, a maioria dos estudos de Drosophila dependem de métodos que são projetados para medir metabólitos individual3, tais como a trealose, triglicérides ou ATP. Como um protocolo específico é necessária para medir cada metabólito, estudos baseados no ensaio são tendenciosas para aqueles compostos que podem ser medidos usando jogos comerciais, caro e trabalhoso. Uma solução para estas limitações emergiu do campo da metabolómica, que fornece um meio mais eficiente e imparcial de estudar o metabolismo de Drosophila . Ao contrário de um estudo baseado em ensaio, uma análise única metabolómica simultaneamente pode medir centenas de metabólitos de pequenas moléculas e fornecem uma compreensão abrangente de estado metabólico6,7 de um organismo. Esta técnica expandiu-se significativamente o âmbito da drosófila estudos metabólicos e representa o futuro deste emergente campo8.
Metabolómica estudos são realizados principalmente utilizando três tecnologias: (i) ressonância magnética nuclear (NMR), (ii) líquida cromatografia / espectrometria de massa (LC-MS) e (iii) cromatografia gasosa / espectrometria de massa (GC-MS)9. Cada abordagem apresenta desvantagens e vantagens distintas, e todas essas tecnologias têm sido usadas para estudar com sucesso o metabolismo de Drosophila . Desde que a pesquisa conduzida em nosso laboratório está focada em metabolitos pequenos, polares, empregamos principalmente um método baseados em GC-MS. GC-MS fornece o usuário com um número de vantagens, incluindo a grande reprodutibilidade, pico resolução, sensibilidade, e a disponibilidade de uma espectral biblioteca de impacto (EI) de elétrons padrão, que permite a identificação rápida de descoberto metabólica características de10,11. A preparação de amostras para GC-MS, no entanto, é um pouco complexa e exige uma cuidadosa atenção aos detalhes. Amostras devem ser coletadas, lavadas, pesava e congeladas em uma maneira que sacia rapidamente reações metabólicas. Além disso, a carcaça da mosca é resistente para protocolos padrão de homogeneização e requer um moinho do grânulo para garantir a extração de metabólito ideal. Finalmente, amostras analisadas por GC-MS devem se submeter a derivatização química antes da deteção12. Enquanto os métodos publicados anteriormente descrevem todas estas etapas3,13,14, um protocolo visual que permita que o usuário iniciante reproducibly gerar dados de alta qualidade ainda é necessária. Aqui vamos demonstrar como preparar amostras de larvas de Drosophila para análise metabolomics baseados em GC-MS. Este protocolo permite que o usuário reproducibly medir muitos dos pequenos metabólitos polares que compõem o metabolismo de carbono central.
Metabolomics oferece uma oportunidade sem precedentes para analisar as reações metabólicas que compõem o metabolismo intermediário. A sensibilidade desta tecnologia, no entanto, processa dados suscetíveis a base genética, pistas do desenvolvimento e uma variedade de estresses ambientais, incluindo temperatura, umidade, densidade populacional e disponibilidade de nutrientes. Portanto, uma alta qualidade e reprodutíveis metabolomics análise exige que as amostras sejam cobrados em condições altamente controladas….
The authors have nothing to disclose.
Graças aos membros do centro de espectroscopia de massa Indiana universidade e a Universidade de Utah Metabolomics facilidade do núcleo de assistência em otimizando este protocolo. JMT é suportado pelo Instituto Nacional de General Medical Ciências, do institutos nacionais da saúde sob prêmio número R35GM119557.
Unsulfured blackstrap molasses | Good Food, INC | ||
Drosophila Agar Type II | Genesee Scientific | 66-103 | |
Pyridine | EMD Millipore | PX2012-7 | |
Methoxyamine hydrocholoride (MOX) | MP Biomedicals, LLC | 155405 | |
MSTFA with 1% trimethylchlorosilane | Sigma | 69478 | |
Fleischmann’s Active dry yeast | AB Mauri Food Inc | 2192 | |
6oz Drosophila stock bottle | Genesee Scientific | 32-130 | |
Soft tissue homogenizing mix (2 mL tubes) | Omni International | SKU:19-627 | |
Vial insert, 250 µL deactivated glass with polymer feet | Agilent | 5181-8872 | |
Succinic acid-2,2,3,3-d4 | Sigma | 293075 | |
SpeedVac | Thermo | SC210A | |
o-Phosphoric acid | Fisher Scientific | A242-1 | |
Propionic acid | Sigma | P5561 | |
p-Hydroxy benzoic acid methyl ester | Genesee Scientific | 20-258 | |
Bead Ruptor | Omni International | SKU:19-040E | |
ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000012 | |
MultiTherm Shaker with a 24 X 12 mm block | Benchmark Scientific | H5000 | |
Methanol | Sigma | 34860 | |
1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 22364111 | |
Falcon 35 X 10 mm tissue culture dish | Corning Incorporated | 353001 | |
GC column | Phenomex | ZB-5MSi |