Fractionation subcellular של דגימות מדרכי העיכול טריים וקפואים
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע של fractionation סלולרית פשוטה לצורך הקמת מכשול ההפרדה subcellular של חלבונים cytoplasmic וגרעיני ב אנושי ביופסיות מעיים טריים וקפואים.
Abstract
המטרה של פרוטוקול זה היא fractionate רקמה אנושית מעיים מתקבל על ידי אנדוסקופיה לתוך תאים גרעינית, cytoplasmic לניתוח לוקליזציה של חלבונים ספציפיים או חלבון מתחמי במדינות רקמות שונות (קרי, בריא נגד המחלה). שיטה זו שימושית עבור fractionation של שתי דגימות רקמה מעיים טריים וקפואים; זה נגיש עבור כל המעבדות לא זמן רב.
Introduction
חלבונים להשתתף כמעט את כל הפונקציות הביולוגי בתוך תא, כל וריאציה במבנה שלהם, כמות או מיקום יכול להוביל תרחיש פתוגניים. רקמות מדגם fractionation שיטות הן בגישה שימושי כדי להפחית את המורכבות של מחלות הקשורות חלבון ניתוחים. מספר מחקרים להשתמש במידע לוקליזציה חלבון או להעשיר את חלבון מתא סלולרית ספציפית, אז עבור fractionation לשחזור של חלבונים שלמים פרוטוקול זה שימושי לענות על שאלות ביולוגיות מסוימות. לקביעת ההתאמה subcellular של חלבונים וניטור הפצה compartmental או אינטראקציות על הבסיס שלהם תנאים המחלה תסייע לזהות מחלה הקשורה הבדלים תפקודיים1,2. לכן, בשיטה זו שואפת reproducibly fractionate רקמת המעי ביופסיות, טריים וקפואים, לתוך תאים subcellular cytoplasmic וגרעיני.
דגימות הביופסיה מעיים מתקבלים באופן שגרתי במהלך אנדוסקופיה הליכים3 (איור 1), יכול לשמש ביעילות עבור כימות חלבון או לימודים immunoprecipitation. מאז דגימות רקמה מן המעי אפיתל יכיל חלבונים אשר עשויים להיות מעורבים ישירות בפתוגנזה המחלה4, דגימות ביופסיה מעיים הם מקור חשוב מאוד לצורך זיהוי מוצלח מעיים מחלות ספציפיות חלבונים. דגימות רקמה, החולה קפוא מאוחסנים יחד עם המידע הקליני הם משאבים שימושיים עבור חלבונים, הכנה מדגם לשחזור ופשוט הוא סוגיה מרכזית לספק מידע compartmental תא באמצעות הגבלת כמויות קפוא רקמות5.
ישנם מספר ערכות זמינים מסחרית לצורך הקמת מכשול ההפרדה של שברים הסלולר, אבל אלה יקרים יותר, בדרך כלל זמן רב יותר מאשר בפרוטוקול המוצג כאן. פרוטוקולים בהתבסס על צנטריפוגה הדרגתיים מרובים-צעד, מעברי צבע רציף גם בעבר שימשו את fractionation של מגוון התאית בתאים ברקמות שונות6,7. עם זאת, שמירה על מרקם של מעברי צבע רציף לעתים קרובות משימה קשה. פרוטוקולים דומה המבוסס על פירוק רציפים של ממברנות תוארו קודם לכן אבל הם בדרך כלל צריך יותר משני מאגרי, הידיים בזמן הוא עוד8 .
כאשר fractionating דגימות רקמה, לזכור את הרקמה הזאת דגימות נוכח תא התא, התא-מטריקס אינטראקציות כי הן לא נוכח בתאים בתרבית חשוב בעת הליך שאיבת חלבון. פירוט נאותה בין תאים מטריצה חוץ-תאית מבלי להשפיע על איכות החלבון יהיה גורם קריטי ב בידוד חלבון9רקמת המעי. ב פרוטוקול זה, אנשי קשר תא התא, התא-מטריקס הם קודם שבור, משחררים את התאים ומאפשר את המאגר להגיע אל התאים הבודדים. כדי למנוע ערבוב לפני fractionation חלבון-תא, פירוט של אנשי הקשר להתרחש מבלי לשנות את התקינות של התאים או את הקרומים גרעיני.
בשל העשרת של פרוטאזות שונים רירית המעי10, חשוב לשלוט השפלה חלבון במהלך החילוץ. כדי למזער את ההשפלה חלבון פוטנציאליים, מעכבי פרוטאז מרובים חייבים להיכלל במאגרי מיצוי חלבונים. בנוסף, אם תמציות עומדים לשמש עבור מבחני פונקציונלי, זה חיוני כדי למנוע את דנטורציה של חלבונים או proteolysis כמו זה יגרום לאובדן חלבון פעילות11. למטרה זו, הפרוטוקול מבוצע ב 4 ° C, phenylmethylsulfonyl טריים פלואוריד (PMSF) מתווסף המאגרים-ריכוז סופי של 0.1 מ מ רק לפני השימוש כדי לעכב עוד יותר proteolysis.
הצעד הראשון תא fractionation הוא שיבוש רקמות פירוק התא. כאמור, המטרה היא disaggregate את התאים ואת לשבור שאותם לפתוח במינימום נזקים. דגימות רקמה מעיים חייבת להיות הומוגני, התאים lysed כדי להשיג שבירה המרבי של קרום התא. ב פרוטוקול זה, אנו משתמשים במערבל שהעקב ממונע לשבור רקמת המעי אשר הוא הומוגני תוך שניות על-ידי פעולה vortexing במהירות גבוהה. לאחר המגון, תאי הרקמות מודגרת בתוך מאגר היפוטוניק יפרץ קרום התא, אך ימנע הגרעינים שלמים, ואחריו תוספת של חומר ניקוי denaturing (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) מערבולת קצר להפרדת הגרעינים מתוך השבר cytoplasmic. לאחר הסרת הציטופלסמה, קרום גרעין התא הוא פרץ לתוך מאגר hypertonic ברעידות.
השיטה המוצגת כאן היא שיטה המתאימה עבור fractionation subcellular של ביופסיות מעיים טריים וקפואים זה הושגו במהלך הליכי אנדוסקופי, נע בין 2 ו- 10 מ”ג במשקל. את הפרוטוקול היא קלה, לשחזור ואת יכולה להתבצע באמצעות מכשור מעבדתי בסיסי, ריאגנטים בתוך פחות משעה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן משמש את fractionation גרעינית, cytoplasmic של ביופסיות מעיים. החלבונים מטוהרת הם לא שפגע בסימני והוא יכול לשמש לא רק בניתוח תספיג כמוצג באיור 2 ו- 3 אלא גם מבחני הדורשים מקופלת מקורי חלבונים כגון immunoprecipitation, electrophoretic ניידות shift assay (EMSA) או יליד לזיהוי בג’ל (עמו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחברים להכיר את הסיוע של לופז Ander ו Miren Telletxea הקלטה ועריכה וידאו. ACR ממומן על-ידי התחברות Ikerbasque של פרויקט מחקר שבסיסה Celiacos דה מדריד (ACM). מחדרהמלון הוא ממומן על ידי פרויקט ISCIII-PI16/00258, והיתה שותפה במימון מאת האיחוד האירופי ERDF/ESF “דרך להפוך את אירופה”. הוא ממומן על ידי מענק פרוייקט מחקר 2015111068 של מחלקת הבריאות בסקית. IRG מלכה פרחיה נתמכים על ידי מענקים מלגת predoctoral את UPV/EHU והבסקים משרד החינוך, בהתאמה.
Materials
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-1kg | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333-1kg | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 5588886-1kg | |
| DTT | Sigma Aldrich | 10197777001 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Proteinase and phosphatase inhibitors | Thermo Scientific | A32959 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | CA-630 | Detergent |
| BCA assay | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification kit |
| Disposable plastic pestles | Sigma Aldrich | Z359947-100EA | |
| Dounce homogeneizer | VWR | 431-0100 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415-R | |
| Shacker | IKA | MS3 basic |
References
- Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).
- Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. Global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellular localization. eLife. 5, (2016).
- Preedy, V. R., Watson, R. R., Ronald, R. . Methods in disease investigating the gastrointestinal tract. , (1998).
- Alex, P., Gucek, M., Li, X. Applications of proteomics in the study of inflammatory bowel diseases: Current status and future directions with available technologies. Inflammatory bowel diseases. 15 (4), 616-629 (2009).
- Ericsson, C., Franzén, B., Nistér, M. Frozen tissue biobanks. Tissue handling, cryopreservation, extraction, and use for proteomic analysis. Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 45 (6), 643-661 (2006).
- Hoffmann, K., et al. New application of a subcellular fractionation method to kidney and testis for the determination of conjugated linoleic acid in selected cell organelles of healthy and cancerous human tissues. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (6), 1138-1144 (2005).
- Foster, L. J., et al. A Mammalian Organelle Map by Protein Correlation Profiling. Cell. 125 (1), 187-199 (2006).
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
- Börner, A., et al. Subcellular protein extraction from human pancreatic cancer tissues. BioTechniques. 46 (4), 297-304 (2009).
- Antalis, T. M., Shea-Donohue, T., Vogel, S. N., Sears, C., Fasano, A. Mechanisms of disease: protease functions in intestinal mucosal pathobiology. Nature clinical practice. Gastroenterology. 4 (7), 393-402 (2007).
- Cutler, P. . Protein purification protocols. , (2004).
- Walker, J. M. The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook. , 11-14 (1996).
- McLane, L. M., et al. Differential localization of T-bet and Eomes in CD8 T cell memory populations. Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 190 (7), 3207-3215 (2013).
- Nguyen, K. T., Holloway, M. P., Altura, R. A. The CRM1 nuclear export protein in normal development and disease. International journal of biochemistry and molecular biology. 3 (2), 137-151 (2012).
