Fractionnement subcellulaire de spécimens gastro-intestinal fraîches ou congelées

Les protéines participent à presque toutes les fonctions biologiques dans une cellule et toute variation dans leur structure, la quantité ou la localisation peut conduire à un scénario de pathogène. Méthodes de fractionnement des échantillons tissulaires sont une approche utile pour réduire la complexité des maladies liées à des analyses de protéines. Certaines études utilisent des informations de localisation de protéine ou enrichissent une protéine d’un compartiment cellulaire spécifique, un protocole pour le fractionnement des protéines intactes reproductible est donc utile de répondre à certaines questions biologiques. Déterminer la localisation sous-cellulaire des protéines et la surveillance de leurs interactions à basale ou redistribution compartimentale et pathologiques permettra d’identifier les maladies liées à des différences fonctionnelles^1,2. Ainsi, cette méthode vise de façon reproductible fractionner des biopsies de tissu intestinal, frais et surgelés, en compartiments subcellulaires cytoplasmiques et nucléaires.

Des échantillons de biopsie intestinale sont régulièrement obtenus au cours de l’endoscopie procédures³ (Figure 1) et peuvent être utilisés efficacement pour la quantification des protéines ou des études de l’immunoprécipitation. Étant donné que les échantillons de tissus d’intestinales épithéliales contiendra des protéines qui peuvent être directement impliqués dans la pathogenèse de la maladie⁴, biopsies intestinales sont une source très précieuse pour l’identification réussie des propres à la maladie intestinale protéines. Des échantillons de tissus de surgelés, patient stockée ainsi que les renseignements cliniques sont des ressources utiles pour l’analyse des protéines, et une préparation simple et reproductible est un enjeu important de fournir des informations parcellaires cellule à l’aide de montants limitatifs de surgelés tissu⁵.

Il existe plusieurs kits disponibles dans le commerce pour la séparation des fractions cellulaires, mais ceux-ci sont plus chers et généralement plus long que le protocole présenté ici. Protocoles basés sur la centrifugation en gradient de plusieurs étapes et des gradients continus ont également servis antérieurement pour le fractionnement des divers compartiments cellulaires dans différents tissus^6,7. Cependant, maintenir l’uniformité des gradients continus est souvent une tâche difficile. Protocoles similaires basées sur la lyse séquentielle des membranes ont été décrits précédemment mais dont ils ont besoin en général de plus de deux tampons et les mains à l’heure n’est plus⁸ .

Lorsque des échantillons de tissus de fractionnement, garder à l’esprit que le tissu des échantillons présents cellule-cellule et cellule-matrice des interactions qui ne sont pas présentes dans les cellules cultivées et important lors de l’extraction de protéines. La ventilation correcte entre cellules et matrice extracellulaire sans affecter la qualité de la protéine sera un facteur essentiel dans le tissu intestinal protéine isolement⁹. Dans ce protocole, cellule-cellule et cellule-matrice de contacts sont d’abord cassés, libérant les cellules et qui permet la mémoire tampon atteindre les cellules individuelles. Pour éviter les protéines-compartiment mélangés avant le fractionnement, la rupture des contacts doit se faire sans altérer l’intégrité des cellules ou les membranes nucléaires.

En raison de l’enrichissement de diverses protéases dans la muqueuse intestinale¹⁰, il est important de contrôler la dégradation des protéines durant l’extraction. Pour minimiser la dégradation potentielle de la protéine, inhibiteur de la protéase multiples doit être inclus dans les tampons d’extraction de protéine. En outre, si des extraits vont être utilisés pour les tests fonctionnels, il est essentiel pour éviter la dénaturation des protéines ou de protéolyse, car cela provoquerait une perte de protéines activité¹¹. À cet effet, le protocole est réalisé à 4 ° C et fluorure phénylméthylsulfonyle fraîches (PMSF) est ajouté pour les tampons à une concentration finale de 0,1 mM juste avant de les utiliser davantage inhibe la protéolyse.

La première étape de fractionnement cellulaire est désorganisation tissulaire et la lyse cellulaire. Tel que mentionné précédemment, l’objectif est de séparer les cellules et la pause que les ouvrir avec le minimum de dommages. Échantillons de tissu intestinal doivent être homogénéisés, et les cellules lysées pour atteindre maximale rupture de la membrane cellulaire. Dans ce protocole, nous utilisons un mélangeur motorisé pilon pour briser le tissu intestinal qui est homogénéisé dans secondes au moyen d’action Vortex à haute vitesse. Après homogénéisation, les cellules des tissus sont incubés dans une mémoire tampon hypotonique qui fera éclater la membrane cellulaire, mais gardera les noyaux intacts, suivie par l’ajout d’un détergent non dénaturants (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) et un court vortex pour séparer les noyaux de la fraction cytoplasmique. Après l’enlèvement du cytoplasme, la membrane du noyau cellulaire est fait irruption dans un tampon hypertonique avec agitation.

La méthode présentée ici est une méthode appropriée pour le fractionnement subcellulaire des frais et congelés des biopsies intestinales qui ont été obtenus au cours de procédures endoscopiques et comprise entre 2 et 10 mg en poids. Le protocole est simple et reproductible et pourrait être effectué à l’aide de matériel de laboratoire de base et des réactifs en moins d’une heure.