Субцеллюлярные фракционирование из свежих и замороженных образцов желудочно-кишечного тракта

Белки участвуют в почти все биологические функции в клетке и любые изменения в их структуры, количества или расположение может привести к патогенным сценарий. Ткани образец фракционирование методы являются полезным подходом для снижения сложности заболевания связанные с анализа белка. Некоторые исследования используют информацию о локализации протеина или обогатить белка от конкретных клеточных отсек, так это протокол для воспроизводимых фракционирование интакт белками полезно ответить на некоторые вопросы, биологические. Определение локализация внутриклеточных белков и мониторинг их полигамное перераспределения или взаимодействий в базальной и условиях заболевания поможет определить заболевание связанные функциональные различия^1,2. Таким образом этот метод призван можно воспроизвести фракционировать кишечных тканей биопсий, свежие и замороженные, на ядерные и цитоплазматические субцеллюлярные отсеков.

Кишечное биопсии образцы обычно получаются во время эндоскопические процедуры³ (рис. 1) и может эффективно использоваться для количественного определения белка или иммунопреципитации исследований. Поскольку образцы ткани из кишечного эпителия будет содержать белки, которые могут быть непосредственно вовлечены в патогенез болезни⁴, кишечное биопсии образцы являются весьма ценным источником для успешной идентификации конкретных кишечных заболеваний белки. Образцы хранимой замороженные, пациент тканей вместе с клинической информации являются полезными ресурсами для анализа белка, и простой и воспроизводимой пробоподготовки является ключевым вопросом для предоставления ячейки полигамное информации с использованием ограничения количества замороженных ткани⁵.

Есть несколько коммерчески доступные наборы для разделения фракций сотовой, но они дороже и вообще больше времени, чем протокол, представленные здесь. Протоколы, основанные на несколько шагов градиентного центрифугирования и непрерывной градиенты ранее использовались также для фракционирования различных клеточных отсеков в различных тканях^6,7. Однако поддержание согласованности непрерывного градиентов часто является трудной задачей. Аналогичные протоколы, основанный на последовательном lysis мембран ранее говорилось, но они обычно требуется более двух буферов и руки на время составляет более⁸ .

Когда фракционирования образцы тканей, имейте в виду что ткани образцы настоящего-клеток и клеток матрица взаимодействия, которые не присутствуют в культивируемых клеток и важным при следовании белка добычу. Надлежащего разбивка между клетками и внеклеточного матрикса без ущерба для качества белка будет решающим фактором в кишечных тканей белка изоляции⁹. В этом протоколе ячеек и ячеек матрицы контакты сначала сломанной, выпустив клетки и позволяя буфера до отдельных ячеек. Чтобы избежать смешивания до фракционирования белков купе, разбивка контактов должны произойти, не изменяя целостность клетки или ядерной мембраны.

За счет обогащения различных протеаз в слизистой оболочке кишечника¹⁰важно контролировать деградации белка во время извлечения. Для сведения к минимуму потенциальной деградации белка, несколько ингибитор протеазы должны быть включены в буферах экстракции белка. Кроме того если выдержки будет использоваться для функциональных анализов, важно избежать денатурации белков или протеолиза, как это может привести к потере активности белков¹¹. Для этой цели протокол выполняется при температуре 4 ° C и свежие phenylmethylsulfonyl фторид (PMSF) добавляется в буферы в конечной концентрации 0,1 мм перед использовать для дальнейшего подавления протеолиза.

Первым шагом в ячейке фракционирование является разрушение тканей и lysis клетки. Как упоминалось ранее, цель заключается в разбивке клетки и разрыв их открытыми с минимальным ущербом. Необходимо гомогенизированных образцов кишечных тканей, и клетки лизированы для достижения максимальной поломки мембраны клетки. В этом протоколе мы используем моторизованный толкатель смеситель сломать кишечника ткани, которая является гомогенизации в течение нескольких секунд с помощью высокой скорости vortexing действий. После гомогенизации ткани клетки инкубируют в гипотонический буфер, который будет взрыв клеточной мембраны, но будет держать ядер нетронутыми, следуют-денатурации моющего средства (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) и коротких вихревых отделить ядер от фракции цитоплазматических. После удаления цитоплазме клеточной мембраны ядер ворвались в гипертонический буфер встряхивании.

Представленные здесь используется соответствующий метод для субцеллюлярные фракционирование свежих и замороженных кишечное биопсии, которые были получены в ходе эндоскопических процедур и колеблется от 2 до 10 мг в весе. Протокол просто и воспроизводимость и может быть выполнена с использованием основного лабораторного оборудования и реагентов в соответствии с час.