Здесь мы продемонстрировать производительность модели минимальный спинного мозга травмы в взрослой мыши, что запчасти Центральный канал нишу жилья эндогенного нервных стволовых клеток (NSCs). Мы покажем, как нейросферы assay может использоваться для количественного определения активации и миграции окончательного и примитивных NSCs, после травмы.
Нервные стволовые клетки (NSCs) в спинном мозге взрослых млекопитающих являются относительно mitotically покоя населения перивентрикулярной клеток, которые могут быть изучены в пробирке с помощью нейросферы assay. Этот assay, образуя колонии является мощным инструментом для изучения реакции NSCs экзогенных факторов в блюдо; Однако это может также использоваться для изучения эффекта в естественных условиях манипуляций с правильное понимание преимуществ и ограничений assay. Один манипуляции клинический интерес является эффект травмы на эндогенные НСК активации. Текущие модели спинного мозга обеспечивают вызов для изучения это как выраженность общих моделей ушиба, сжатия и перерезка вызывают разрушение НСК нишу на месте травмы, где находятся стволовые клетки. Здесь мы описываем минимальной травмы модель, которая вызывает локализованные повреждения на поверхности поверхностных Дорсолатеральное нижнего уровня (T7/8) грудного отдела спинного мозга взрослого мыши. Эта модель травмы запчасти Центральный канал на уровне травмы и позволяет анализ NSCs, которые находятся на уровне поражения в различные моменты времени после травмы. Здесь, мы покажем, как assay нейросферы могут быть использованы для изучения активации двух отдельных, линейный связанных, популяций NSCs, которые находятся в регионе перивентрикулярной спинного мозга-примитивных и окончательного NSCs (pNSCs и dNSCs, соответственно). Мы продемонстрируем изолировать и культуры эти NSCs от перивентрикулярной региона на уровне травмы и травмы сайт белого вещества. Наши послеоперационные спинного вскрытия показывают увеличение числа ПНШК и dNSC производные neurospheres из региона перивентрикулярной раненых по сравнению с элементами управления, выступая для их активации через травмы связок. Кроме того, после травмы, neurospheres, dNSC производные могут быть изолированы от места повреждения, демонстрируя способность NSCs мигрировать из их перивентрикулярной нишу сайты травмы.
Центральной нервной системы содержит субпопуляции самостоятельного обновления, Multipotent с экстрактами стволовых клеток, которые способны привести к возникновению всех различных Зрелые нейронных клеток типы1,2,3,4. Эти нервные стволовые клетки (NSCs) проживают в специализированных нишах в мозг и спинной мозг и может быть активирован после травмы размножаться, мигрировать и дифференцироваться в зрелых нервные клетки. Было показано, что NSCs и их потомства мигрируют к месту травмы в кортикальной травмы модели5,6. В головном мозге NSCs показали мигрировать из боковых желудочков на сайт травмы, где они дифференцируют в астроциты, которые способствуют глиальных шрам формирования7. В спинном мозге однако, было сделано несколько исследований спросить, если эти же эндогенных NSCs может быть использована для поощрения восстановления после травмы спинного мозга. Действительно в настоящее время дискуссии относительно того, требует ли активации стволовых клеток пула в спинном прямого физического ущерба перивентрикулярной ниши, накладки Центральный канал8 или если повреждения спинного шнур паренхимы (оставляя ствола клетки ниши нетронутыми) достаточно для того активировать эндогенного NSCs9.
Ряд моделей спинного травме (ТСТ) были использованы для изучения патофизиологии острые и хронические травмы. Эти модели также использовались для проверки потенциальных терапии для лечения SCI через нейропротекции, иммуномодулирующие и развивающихся клеток Трансплантация/замена стратегии10,11,13. Текущие модели включают в себя сжатие или ушиба травм, которые вызывают крупномасштабных функциональных дефицита, а также обширные поражения и кавитаций в шнур14,15. Результирующая глиальных шрамы могут охватывать несколько сегментов спинного мозга наряду с большинством ширина/окружности спинного16. Таким образом хотя эти модели являются клинически значимых, они могут позволить значительные проблемы для изучения реакции эндогенного NSCs после травмы. Существуют химические модели повреждений, которые могут быть адаптированы к привести к мягкой форм вреда, который может избавить Центральный канал17. Однако эти типы травм сосредоточить внимание на связанных с SCI демиелинизации и не являются клинически значимые модели для физические или механические повреждения, связанных с травматическим SCI.
Чтобы устранить ограничения текущей травмы моделей, мы адаптировали иглы трек минимальный SCI модель, первоначально разработанная в крыса9, для применения в модели взрослых мыши. Наша модель адаптирована травмы может создать последовательную поражением Дорсолатеральное региона спинного мозга мыши и запасных Центральный канал на Этажность травма. Преимуществом этой модели является, что она позволяет исследование кинетики НСК после травмы и их потенциальных радиальных миграции на сайт травмы. Использование мыши модели также допускает использование трансгенных мышей, которые позволяют линии отслеживания эндогенного NSCs и их потомства после травмы. Свойства NSCs, далее может оцениваться с использованием модифицированных формы в vitro нейросферы assay, который вводится в настоящем Протоколе.
Assay нейросферы является в vitro колонии формируя assay который позволяет изоляции NSCs присутствии митогенов. На клоновых обшивка плотности отдельных NSCs размножаться привести к свободно плавающего сферические колонии клеток, которые состоят из небольшой субпопуляции NSCs и подавляющее большинство прародителями18,19. В нашем протокол, мы демонстрируем изоляции двух отдельных, линейный, связанных с NSCs из региона перивентрикулярной спинного мозга — в исходных условиях и после нашей минимальной SCI модели. Окончательным нервных стволовых клеток (dNSCs) Экспресс Нестин и глиальных фибриллово кислой белка (СВМС) и выращиваются в присутствии эпидермального фактора роста (EGF), фактор роста фибробластов (ФБП) и гепарина (совместно называемых EFH)20. Эти dNSCs являются редкими в наивно спинного мозга, что приводит к очень мало neurospheres в пробирке. Тем не менее мы показывают, что dNSCs активируются после минимальной SCI, расширение числа neurospheres, изолированных от региона перивентрикулярной21. Примитивные нервные стволовые клетки (pNSCs) вверх по течению от dNSCs в линии нервных стволовых клеток. pNSCs являются чрезвычайно редки, Ускоренная низкий уровень плюрипотентности маркера Oct4 и лейкемия ингибирующего фактора (LiF) реагировать22. pNSCs не образуют neurospheres при изоляции от спинного мозга взрослого мыши вследствие наличия основного белка миелина (MBP) в первичных культур; Однако, ПНШК neurospheres могут быть изолированы от MBP несовершенным мышей и их численность расширенного следующие травмы — похож на dNSCs21. Наконец мы покажем, что dNSC производные neurospheres могут быть изолированы от сайта травмы в начале раз после минимальной SCI. Эти результаты демонстрируют, что наша модель травмы и анализов можно оценить характеристики активации перивентрикулярной NSCs как их способность размножаться и мигрируют в ответ на травмы.
В ходе хирургической процедуры есть несколько важных шагов, где исследователь должен уделять особое внимание для того, чтобы получить оптимальные результаты и минимизировать изменчивость между животными. Необходимо проявлять осторожность при ингаляционной анестезии (изофлюрановая)…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа финансируется Фондом Krembil (эксплуатационные Грант CMM). WX был удостоен премии Студенческая Carlton Маргерит Смит. NL получил стипендию аспирантов Онтарио.
Agricola Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
Moria Vannas-Wolff Spring Scissors (Curved) | Fine Science Tools | 15370-50 | Customize when ordering to get blunted tips |
Graefe Forceps (Straight, 1×2 Teeth) | Fine Science Tools | 11053-10 | |
Extra Fine Graefe Forceps (Curved, Serrated) | Fine Science Tools | 11152-10 | Or any other forceps for suturing |
Hartman Hemostats (Straight) | Fine Science Tools | 13002-10 | Or any other appropriate for suturing |
Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Or any other appropriate |
Hair clippers | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA | or any other appropriate |
Stereotaxic instrument | Stoeling | 51500 | or any other appropriate |
Buprenorphine | or any appropirate sanctioned my animal care facility | ||
Meloxicam | or any appropriate sanctioned by animal care facility | ||
Tears Naturale P.M. | Alcon | https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE | or any other appropriate |
Isoflurane | Baxter International Inc | DIN 02225875 | or any other appropriate for anesthesia |
Q-tips Cottom Swabs | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS | |
Cotton Gauze | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
30G Needles | Becton Dickinson | 305106 | For Injury |
25G Needles | Becton Dickinson | 305122 | For Drug injections |
1mL Syringes | Becton Dickinson | 3090659 | for drug injections |
3mL Syringes | Becton Dickinson | 309657 | for fluid injections |
4-0 Suture | uoftmedstore.com | 2297-VS881 | for skin suturing |
6-0 Suture | uoftmedstore.com | VS889 | for muscle suturing |
Polysporin ointment | amazon.ca | 102051 | |
Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 901806 | |
15mL conical tubes | ThermoFisher | Any appropriate | |
Petri Dishes | ThermoFisher | any appropriate | |
Trypan Blue | ThermoFisher | Any | |
Hemocytometer | ThermoFisher | Any appropriate | |
Centrifuge | ThermoFisher | Any appropriate | |
Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||
Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
Counting Microscope | Olympus | CKX41 | |
Neural Basal-A Medium | Invitrogen | 10888-022 | |
B27 | Invitrogen | 17404-044 | |
Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15070 | |
L- Glutamine | Gibco | 25030 | |
DMEM | Invitrogen | 12100046 | |
F12 | Invitrogen | 12700075 | |
30% Glucose | Sigma | G6152 | 1M- 9.01g in 100mL dH2O |
1M Glucose | |||
7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | 155mM- 1.30g in 100mL dH2O |
155mM NaHCO3 | |||
1M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g in 100mL dH2O |
Apo-Transferrin | R&D Systems | 3188-AT | |
Putrescine | Sigma | P7505 | |
Insulin | Sigma | I5500 | |
Selenium | Sigma | S9133 | |
Progesterone | Sigma | P6149 | |
Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | 1 vial of papain can be used for 2 samples |
Epidermal Growth Factor | Invitrogen | PMG8041 | Powder reconstituted with 1mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer |
Fibroblast Growth Factor | Invitrogen | PHG0226 | Powder reconstituted with 0.5mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer |
Heparin | Sigma | H3149 | |
Leukemia Inhibitory Factor | In House | ||
Trypan Blue | |||
Hemocytometer | |||
24 well Plates | NUNC | ||
2M NaCl | Sigma | S5886 | 11.69g in 100mL dH2O |
1M KCL | Sigma | P5405 | 7.46g in 100mL dH2O |
1M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33g in 100mL dH2O |
108mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59g in 100mL dH2O |