Neurosphere Assay כדי להעריך את הפעלת אנדוגני תאי גזע עצביים במודל של עכברים של פגיעה בחוט השדרה מינימלי
Summary
. הנה, נדגים את הביצועים של מודל פגיעה בחוט השדרה מינימלי עכבר למבוגרים זה חוסך הנישה התעלה המרכזית דיור אנדוגני תאי גזע עצביים (NSCs). אנו מראים כיצד ניתן להשתמש וזמינותו neurosphere לכמת הפעלה והעברה של NSCs סופית ופרימיטיבי בעקבות פגיעה.
Abstract
תאי גזע עצביים (NSCs) בחוט השדרה יונקים בוגרים הם אוכלוסיה יחסית mitotically השבתה הדרגתית של תאים periventricular, כי יכול להיות למד במבחנה באמצעות וזמינותו neurosphere. זה וזמינותו המושבה יוצרי הוא כלי רב עוצמה כדי ללמוד את התגובה של NSCs גורמים אקסוגניים בצלחת; עם זאת, זה יכול לשמש גם כדי לחקור את השפעת ויוו מניפולציות עם ההבנה נכונה היתרונות והמגבלות של וזמינותו. מניפולציה אחת של הריבית קלינית היא ההשפעה של פגיעה על ההפעלה לבטחון לאומי אנדוגני. המודלים הנוכחיים של פגיעה בחוט השדרה לספק אתגר ללמוד זאת כמו חומרת דגמים נפוצים החבורה, דחיסה, חיתוך לגרום להרס של הגומחה לבטחון לאומי באתר של הפגיעה בו שוכנים תאי גזע. כאן נתאר מודל מינימלי פגיעה הגורמת נזק מקומי על פני דורסולטרלי שטחית של רמת בית החזה התחתון (T7/8) של חוט השדרה העכבר למבוגרים. מודל פציעה זה חוסך את התעלה המרכזית ברמה של פציעה, מאפשרת ניתוח של NSCs השוכנים ברמה של הנגע בנקודות זמן שונות בעקבות פגיעה. . הנה, אנחנו מראים איך וזמינותו neurosphere יכול להיות מנוצל כדי ללמוד את ההפעלה של שתי האוכלוסיות ברורה, lineally הקשורות, של NSCs השוכנים באזור periventricular בחוט השדרה – פרימיטיבי ומוחלטת NSCs (pNSCs ו- dNSCs, בהתאמה). נדגים כיצד לבודד, תרבות אלה NSCs מאזור periventricular ברמה של פציעה ואתר פציעה חומר לבן. ניתוח לאחר ניתוח בחוט השדרה שלנו מראים מספר רב יותר של pNSC, neurospheres dNSC, נגזר מאזור periventricular של מיתרי פצוע לעומת שולט, מדבר עם ההפעלה שלהם באמצעות פגיעה. יתר על כן, בעקבות פציעה, נגזר dNSC neurospheres ניתן לבודד מאתר פגיעה — להפגין את היכולת של NSCs להעביר מ משרה periventricular לאתרים של פציעה.
Introduction
מערכת העצבים המרכזית מכילה את subpopulation של תאי גזע עצמי המתחדש, multipotent, כי יש את היכולת להצמיח כל תא עצבי בוגרת אחרת סוגים1,2,3,4. אלה בתאי גזע עצביים (NSCs) שוכנים בתוך נישות מיוחדות במוח ובחוט השדרה, יכול להיות מופעל בעקבות פגיעה כדי להתרבות, להעביר וכדי להבדיל לתוך התאים העצביים בוגרים. NSCs, הצאצאים שלהם הוכחו להעברת אתר פגיעה פגיעה בקליפת המוח מודלים5,6. במוח, NSCs הוכחו להגר מן החדרים הצדדיים האתר של פגיעה בו הם להתמיין האסטרוציטים שתורמים היווצרות צלקת גליה7. בחוט השדרה, עם זאת, מחקרים מעטים נעשו כדי לשאול אם ניתן לשלוט NSCs אנדוגני באותו אלה כדי לקדם את ההחלמה בעקבות פגיעה בחוט השדרה. אכן, אין כיום ויכוח הפעלת הבריכה תאי גזע בחוט השדרה דורשת נזק פיזי ישיר של הגומחה periventricular רירית התעלה המרכזית8 או אם הנזק השדרה כבל parenchyma (עוזב את הגבעול גומחת תאי שלם) מספיקה להפעיל את NSCs אנדוגני9.
היו בשימוש מספר מודלים פציעה (SCI) בחוט השדרה ללמוד הפתופיזיולוגיה של פציעה אקוטי וכרוני. מודלים אלה שימשו גם לבדוק טיפולים פוטנציאליים לטיפול SCI דרך neuroprotection, immunomodulation, המתפתח תא השתלת/החלפה אסטרטגיות10,11,13. המודלים הנוכחיים כוללים פציעות דחיסה ו/או החבורה, אשר לגרום גירעונות פונקציונלי בקנה מידה גדול כמו גם נגעים נרחבים cavitations כבל ה-14,15. צלקות גליה הנובעת יכולה להקיף מספר מקטעים בעמוד השדרה יחד עם הרוב המכריע של ההיקף/הרוחב של השדרה ה-16. לכן, בעוד אלו הדגמים הם הרלוונטית קלינית, הם יכולים להרשות לעצמם אתגרים משמעותיים כדי ללמוד את התגובה של NSCs אנדוגני בעקבות פגיעה. ישנם דגמים כימי של פציעה זה ניתן להתאים לגרום צורות קלות של פציעה יכול לתת לי את התעלה המרכזית17. עם זאת, סוגים אלה של פציעה להתמקד demyelination המשויך SCI, הן לא דוגמניות הרלוונטית קלינית נזק גופני ו/או מכני הקשורים לביוטכנולוגיה טראומטי
כדי לטפל המגבלות של המודלים הנוכחיים של פציעה, אנחנו הסתגלו מחט מסלול מינימלי SCI מודל, שפותחה במקור בשנת החולדה9, עבור היישום במודל עכברים בוגרים. המודל שלנו פגיעה מותאם ניתן ליצור פגיעה עקבית של אזור דורסולטרלי של חוט השדרה העכבר, לוותר על התעלה המרכזית-level(s) של פגיעה. היתרון של מודל זה הוא כי הוא מאפשר המחקר של המועצה לבטחון לאומי קינטיקה בעקבות פציעות והעברה רדיאלי הפוטנציאליים שלהם לאתר של פציעה. השימוש של מודל עכבר מאפשרת גם שימוש העכברים הטרנסגניים המאפשרים מעקב אחר שושלת היוחסין של NSCs אנדוגני, הצאצאים שלהם בעקבות פגיעה. וצריך להעריך את המאפיינים של NSCs עוד יותר באמצעות הטופס ששונתה של במבחנה neurosphere וזמינותו שהוצגה במאמר פרוטוקול זה.
הבדיקה neurosphere היא במבחנה המושבה יוצרי assay המתיר את ניתוקה של NSCs בנוכחות mitogens. -ציפוי המשובטים צפיפויות, NSCs בודדים להתרבות כדי להצמיח לתרשים כדורית מושבות תאים מורכבות של subpopulation קטן של NSCs, הרוב המכריע של אבות18,19. בפרוטוקול שלנו, נדגים את ניתוקה של שני NSCs נפרדים, הקשורים lineally מאזור periventricular של חוט השדרה — בתנאים בסיסית, בעקבות המודל שלנו-SCI מינימלי. מהווים הסופית עצבית גזע nestin אקספרס תאים (dNSCs) ואת החלבון חומצי fibrillary גליה (GFAP), גדלים בנוכחות גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), גורם הצמיחה פיברובלסט (FGF) והפרין (הנקרא יחד EFH)20. DNSCs אלה הם נדירים בחוט השדרה תמימה, והוליד מעט מאוד neurospheres במבחנה. עם זאת, אנו מראים כי dNSCs מופעלים בעקבות SCI מינימלי, מרחיבה את המספרים של neurospheres מבודד את אזור periventricular21. תאי גזע עצביים פרימיטיבי (pNSCs) הם הזרם של dNSCs בשושלת תאי גזע עצביים. pNSCs ונדירה, אקספרס רמות נמוכות של דה מרקר pluripotency Oct4, והם לוקמיה מעכבות פקטור (LiF) מגיב22. pNSCs לא עושים בצורת neurospheres כאשר מבודד מן חוט השדרה העכבר למבוגרים בשל נוכחותם של המיאלין הבסיסי חלבון (MBP) בתרבויות הראשי; עם זאת, pNSC neurospheres ניתן לבודד של MBP עכברים לקוי, מספרם הפציעה הבאה המורחב — בדומה dNSCs21. לבסוף, נראה כי נגזר dNSC neurospheres ניתן לבודד מהאתר של פגיעה ב מוקדם פעמים בעקבות לביוטכנולוגיה מינימלי ממצאים אלה מדגימים שלנו דגם פציעה, מבחני יכול להעריך את מאפייני ההפעלה של periventricular NSCs כגון היכולת שלהם להתרבות ולהעביר בתגובה לפציעה.
Protocol
Representative Results
Discussion
במהלך ההליך הכירורגי, ישנם כמה צעדים קריטי שבו החוקר צריך תשומת לב מיוחדת על מנת להשיג תוצאות אופטימליות, למזער את השתנות בין בעלי חיים. חייבים להקפיד עם ההרדמה בשאיפה (איזופלוריין) במהלך הניתוח כפי ההרדמה הוכח יש אפקטים neuroprotective עם חשיפה ממושכת27. בהתאם לכך, לומדים יכולת ההתחד?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו ממומנת על ידי קרן Krembil (הפעלה גרנט CMM). WX היה זוכת הפרס סטודנט קרלטון מרגריט סמית. NL קיבל מלגת בוגר אונטריו.
Materials
| Agricola Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
| Moria Vannas-Wolff Spring Scissors (Curved) | Fine Science Tools | 15370-50 | Customize when ordering to get blunted tips |
| Graefe Forceps (Straight, 1×2 Teeth) | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Extra Fine Graefe Forceps (Curved, Serrated) | Fine Science Tools | 11152-10 | Or any other forceps for suturing |
| Hartman Hemostats (Straight) | Fine Science Tools | 13002-10 | Or any other appropriate for suturing |
| Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Or any other appropriate |
| Hair clippers | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA | or any other appropriate |
| Stereotaxic instrument | Stoeling | 51500 | or any other appropriate |
| Buprenorphine | or any appropirate sanctioned my animal care facility | ||
| Meloxicam | or any appropriate sanctioned by animal care facility | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE | or any other appropriate |
| Isoflurane | Baxter International Inc | DIN 02225875 | or any other appropriate for anesthesia |
| Q-tips Cottom Swabs | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS | |
| Cotton Gauze | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| 30G Needles | Becton Dickinson | 305106 | For Injury |
| 25G Needles | Becton Dickinson | 305122 | For Drug injections |
| 1mL Syringes | Becton Dickinson | 3090659 | for drug injections |
| 3mL Syringes | Becton Dickinson | 309657 | for fluid injections |
| 4-0 Suture | uoftmedstore.com | 2297-VS881 | for skin suturing |
| 6-0 Suture | uoftmedstore.com | VS889 | for muscle suturing |
| Polysporin ointment | amazon.ca | 102051 | |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 901806 | |
| 15mL conical tubes | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Petri Dishes | ThermoFisher | any appropriate | |
| Trypan Blue | ThermoFisher | Any | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Centrifuge | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Counting Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Neural Basal-A Medium | Invitrogen | 10888-022 | |
| B27 | Invitrogen | 17404-044 | |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15070 | |
| L- Glutamine | Gibco | 25030 | |
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |
| F12 | Invitrogen | 12700075 | |
| 30% Glucose | Sigma | G6152 | 1M- 9.01g in 100mL dH2O |
| 1M Glucose | |||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | 155mM- 1.30g in 100mL dH2O |
| 155mM NaHCO3 | |||
| 1M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g in 100mL dH2O |
| Apo-Transferrin | R&D Systems | 3188-AT | |
| Putrescine | Sigma | P7505 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Selenium | Sigma | S9133 | |
| Progesterone | Sigma | P6149 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | 1 vial of papain can be used for 2 samples |
| Epidermal Growth Factor | Invitrogen | PMG8041 | Powder reconstituted with 1mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer |
| Fibroblast Growth Factor | Invitrogen | PHG0226 | Powder reconstituted with 0.5mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | In House | ||
| Trypan Blue | |||
| Hemocytometer | |||
| 24 well Plates | NUNC | ||
| 2M NaCl | Sigma | S5886 | 11.69g in 100mL dH2O |
| 1M KCL | Sigma | P5405 | 7.46g in 100mL dH2O |
| 1M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33g in 100mL dH2O |
| 108mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59g in 100mL dH2O |
References
- Johansson, C. B., et al. Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system. Cell. 96 (1), 25-34 (1999).
- McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276 (5309), 66-71 (1997).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), 1433-1438 (2000).
- Temple, S., Alvarez-Buylla, A. Stem cells in the adult mammalian central nervous system. Current Opinion in Neurology. 9 (1), 135-141 (1999).
- Zhang, R., et al. Activated neural stem cells contribute to stroke-induced neurogenesis and neuroblast migration toward the infarct boundary in adult rats. Journal Of Cerebral Blood Flow And Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).
- Komitova, M., Mattsson, B., Johansson, B. B., Eriksson, P. S. Enriched environment increases neural stem/progenitor cell proliferation and neurogenesis in the subventricular zone of stroke-lesioned adult rats. Stroke. 36 (6), 1278-1282 (2005).
- Faiz, M., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone give rise to reactive astrocytes in the cortex after stroke. Cell Stem Cell. 17 (5), 624-634 (2015).
- Ren, Y., et al. Ependymal cell contribution to scar formation after spinal cord injury is minimal, local and dependent on direct ependymal injury. Science Reports – UK. 7, (2017).
- Mothe, A. J., Tator, C. H. Proliferation, migration, and differentiation of endogenous ependymal region stem/progenitor cells following minimal spinal cord injury in the adult rat. Neuroscience. 131 (1), 177-187 (2005).
- Thuret, S., Moon, L. D., Gage, F. H. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nature Reviews Neuroscience. 7 (8), 628-643 (2006).
- Bethea, J. R., et al. Systemically administered interleukin-10 reduces tumor necrosis factor-alpha production and significantly improves functional recovery following traumatic spinal cord injury in rats. Journal of Neurotrauma. 16 (10), 851-863 (1999).
- Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 209 (2), 378-388 (2008).
- Cummings, B. J., et al. Human neural stem cells differentiate and promote locomotor recovery in spinal cord-injured mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (39), 14069-14074 (2005).
- Beattie, M. S., Hermann, G. E., Rogers, R. C., Bresnahan, J. C. Cell death in models of spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 37-47 (2002).
- Metz, G. A., et al. Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).
- Faulkner, J. R., et al. Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 24 (9), 2143-2155 (2004).
- Cheriyan, T., et al. Spinal cord injury models: a review. Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).
- Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay. Neural Cell Transplantation: Methods and Protocols. , 91-101 (2009).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nature Methods. 3 (10), (2006).
- Mignone, J. L., Kukekov, V., Chiang, A. S., Steindler, D., Enikolopov, G. Neural stem and progenitor cells in nestin-GFP transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 469 (3), 311-324 (2004).
- Xu, W., et al. Myelin basic protein regulates primitive and definitive neural stem cell proliferation from the adult spinal cord. Stem Cells. 35 (2), 485-496 (2017).
- Sachewsky, N., et al. Primitive neural stem cells in the adult mammalian brain give rise to GFAP-expressing neural stem cells. Stem Cell Reports. 2 (6), 810-824 (2014).
- Mothe, A., Tator, C. H. Isolation of neural stem/progenitor cells from the periventricular region of the adult rat and human spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
- Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Xiong, L., et al. Preconditioning with isoflurane produces dose-dependent neuroprotection via activation of adenosine triphosphate-regulated potassium channels after focal cerebral ischemia in rats. Anesthesia and Analgesia. 96 (1), 233-237 (2003).
- Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats. Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).
- Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
