Un dosage Neurosphère pour évaluer l’Activation endogène cellules souches neurales dans un modèle murin de minime de la moelle épinière
Summary
Ici, nous démontrons la performance d’un modèle de blessures médullaires minime dans une souris adulte qui épargne la niche de canal central logement cellules souches neuronales endogènes (CNS). Nous montrons comment le dosage Neurosphère peut être utilisé pour quantifier l’activation et la migration des CNS primitifs et définitifs après une blessure.
Abstract
Des cellules souches neurales (CNS) dans la moelle épinière chez les mammifères adulte sont une population relativement mitotiquement quiescente de leucomalacie cellules qui peuvent être étudiés in vitro à l’aide du test Neurosphère. Ce dosage formatrices est un outil puissant pour étudier la réaction des CNS à des facteurs exogènes dans un plat ; Toutefois, cela permet également d’étudier l’effet des manipulations de in vivo avec la bonne compréhension des points forts et les limites du dosage. Une manipulation de l’intérêt clinique est l’effet d’une lésion sur activation endogène de NSC. Les modèles actuels de la moelle épinière constituent un défi d’étudier ce que la gravité des modèles courants de contusion, compression et transection provoquent la destruction de la niche du NSC sur le site de la lésion, où résident les cellules souches. Nous décrivons ici un modèle de blessure minime qui provoque des dommages localisés à la surface superficielle dorso-latérale du niveau thoracique inférieur (T7/8) de la moelle épinière de souris adulte. Ce modèle de blessure du canal central au niveau de la blessure de pièces de rechange et permet l’analyse des CNS qui résident au niveau de la lésion à divers moments après une blessure. Ici, nous montrons comment le dosage Neurosphère peut être utilisé pour étudier l’activation de ces deux populations distinctes, linéaire-connexes, des CNS qui résident dans la région de la moelle épinière périventriculaire – CNS primitifs et définitifs (pNSCs et dNSCs, respectivement). Nous démontrons comment isoler et de la culture de ces CNS de la région périventriculaire au niveau de la lésion et le site de lésion de la substance blanche. Nos dissections médullaire postopératoire montrent un nombre accru de pNSC et neurospheres dNSC provenant de la région périventriculaire de cordons lésés par rapport aux témoins, s’adressant à leur mise en route par l’intermédiaire de blessures. En outre, après blessure, neurospheres dNSC dérivés peuvent être isolés depuis le site de la lésion, démontrant la capacité du CNS pour migrer de leur niche périventriculaire aux sites de blessure.
Introduction
Le système nerveux central contient une sous-population de cellules souches autorenouvellement, multipotentes qui ont la capacité de donner lieu à toutes les cellules neurales adultes différents types1,2,3,4. Ces cellules souches neurales (CNS) résident dans des créneaux spécialisés dans le cerveau et la moelle épinière et peut être activées après une blessure pour proliférer, migrer et se différencier en cellules neuronales matures. CNS et leur progéniture ont démontré à migrer vers le site de la lésion dans les lésions corticales modèles5,6. Dans le cerveau, les CNS ont démontré pour migrer des ventricules latéraux à l’endroit de la blessure où ils se différencient en astrocytes qui contribuent à la formation de la cicatrice gliale7. Dans la moelle épinière, cependant, peu d’études a été menée pour demander si ces mêmes CNS endogènes peuvent être exploitées pour favoriser la récupération après une lésion de la moelle épinière. En effet, il y a actuellement un débat quant à savoir si l’activation de la piscine de cellules souches dans la moelle épinière requiert un dommage physique direct de la niche de leucomalacie bordant le canal central8 ou si les dommages à la moelle fil parenchyme (en laissant la tige niche de cellules intacte) est suffisante pour activer endogène CNS9.
Un certain nombre de modèles de lésion (SCI) de la moelle épinière ont été utilisé pour étudier la physiopathologie des lésions aiguës et chroniques. Ces modèles ont aussi été utilisés pour tester des traitements potentiels pour traiter les SCI par le biais de neuroprotection, immunomodulation et développement cell transplantation/remplacement stratégies10,11,13. Les modèles actuels incluent compression ou contusion, blessé, provoquant des déficits fonctionnels à grande échelle ainsi que de lésions étendues et de cavitation dans le cordon14,15. Les cicatrices gliales qui en résultent peuvent s’étendre sur plusieurs segments de la colonne vertébrale ainsi que la majorité de la largeur/circonférence de la moelle épinière16. Ainsi, alors que ces modèles sont cliniquement pertinents, ils permettre des défis importants pour étudier la réponse des CNS endogènes après une blessure. Il existe des modèles chimiques de blessure qui peut être adapté pour provoquer des formes bénignes de blessure qui peut épargner le canal central17. Toutefois, ces types de blessures se concentrent sur la démyélinisation associée SCI et ne sont pas des modèles cliniquement pertinents pour les dommages physiques et/ou mécaniques associés SCI traumatique.
Pour pallier les lacunes des modèles actuels de blessures, nous avons adapté un aiguille piste SCI modèle minimal, développé à l’origine dans la rat9, pour l’application dans un modèle de souris adulte. Notre modèle adapté de blessure peut créer une lésion cohérente de la région dorso-latérale de la moelle épinière de souris et le canal central au ou les niveaux de la blessure de rechange. L’avantage de ce modèle est qu’il permet l’étude de la cinétique de NSC suite à des blessures et leur éventuelle migration radiale à l’endroit de la blessure. L’utilisation d’un modèle de souris permet aussi l’utilisation de souris transgéniques qui permettent le suivi de la lignée des CNS endogènes et leur progéniture après une blessure. Les propriétés des CNS plus loin peuvent être évaluées qu’en utilisant une forme modifiée de l’essai in vitro Neurosphère qui est introduit dans le présent protocole.
L’essai de Neurosphère est un essai in vitro formatrices avec qui permet l’isolement des CNS en présence de mitogènes. Aux densités de placage clonale, CNS individuels se multiplient pour donner naissance à des colonies sphériques flottants de cellules qui sont constitués d’une petite sous-population des CNS et une grande majorité des progéniteurs18,19. Dans notre protocole, nous démontrons l’isolement des deux CNS distinctes liées à l’horloge, de la région périventriculaire de la moelle épinière — en conditions basales et en suivant notre modèle SCI minimal. Définitif neural tige nestin express (dNSCs) des cellules et la protéine fibrillaire acide gliale (GFAP) et sont cultivées en présence de facteur de croissance épidermique (EGF), facteur de croissance fibroblastique (FGF) et l’héparine (ensemble dénommée EFH)20. Ces dNSCs sont rares dans la moelle épinière naïf, donnant lieu à très peu neurospheres in vitro. Cependant, nous montrons que les dNSCs sont activés après SCI minime, élargissant le nombre des neurospheres isolées de la région de leucomalacie21. Primitive des cellules souches neurales (pNSCs) sont en amont de dNSCs dans la lignée de cellules souches neurales. pNSCs sont extrêmement rares, expresses de faibles niveaux de la pluripotence marqueur Oct4 et leucémie facteur inhibiteur (LiF) réactif22. pNSCs ne font pas neurospheres quand isolées de la moelle épinière de souris adultes en raison de la présence de la protéine basique de la myéline (PBM) dans des cultures primaires ; Cependant, neurospheres pNSC peuvent être isolés des souris déficientes en MBP et leur nombre est élargie après une blessure — similaire à dNSCs21. Enfin, nous montrons que neurospheres dNSC dérivés peuvent être isolés de l’endroit de la blessure à tôt fois suite SCI minimes. Ces résultats démontrent que notre modèle de blessures et les dosages peuvent évaluer les caractéristiques de l’activation de leucomalacie CNS comme leur capacité à proliférer et migrent en réponse à une lésion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Au cours de l’intervention chirurgicale, il y a quelques étapes critiques où le chercheur devrait accorder une attention particulière aux afin d’obtenir des résultats optimaux et de réduire la variabilité entre les animaux. Il faut avec l’anesthésie par inhalation (isoflurane) au cours de la chirurgie comme l’anesthésie s’est avéré avoir des effets neuroprotecteurs avec exposition prolongée27. Par conséquent, lorsque l’on étudie la capacité de régénération de la moelle ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est financé par la Fondation Krembil (subvention de fonctionnement CMM). WX a été le récipiendaire de la bourse d’études de Carlton Marguerite Smith. NL a reçu une bourse d’études supérieures de l’Ontario.
Materials
| Agricola Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
| Moria Vannas-Wolff Spring Scissors (Curved) | Fine Science Tools | 15370-50 | Customize when ordering to get blunted tips |
| Graefe Forceps (Straight, 1×2 Teeth) | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Extra Fine Graefe Forceps (Curved, Serrated) | Fine Science Tools | 11152-10 | Or any other forceps for suturing |
| Hartman Hemostats (Straight) | Fine Science Tools | 13002-10 | Or any other appropriate for suturing |
| Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Or any other appropriate |
| Hair clippers | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA | or any other appropriate |
| Stereotaxic instrument | Stoeling | 51500 | or any other appropriate |
| Buprenorphine | or any appropirate sanctioned my animal care facility | ||
| Meloxicam | or any appropriate sanctioned by animal care facility | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE | or any other appropriate |
| Isoflurane | Baxter International Inc | DIN 02225875 | or any other appropriate for anesthesia |
| Q-tips Cottom Swabs | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS | |
| Cotton Gauze | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| 30G Needles | Becton Dickinson | 305106 | For Injury |
| 25G Needles | Becton Dickinson | 305122 | For Drug injections |
| 1mL Syringes | Becton Dickinson | 3090659 | for drug injections |
| 3mL Syringes | Becton Dickinson | 309657 | for fluid injections |
| 4-0 Suture | uoftmedstore.com | 2297-VS881 | for skin suturing |
| 6-0 Suture | uoftmedstore.com | VS889 | for muscle suturing |
| Polysporin ointment | amazon.ca | 102051 | |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 901806 | |
| 15mL conical tubes | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Petri Dishes | ThermoFisher | any appropriate | |
| Trypan Blue | ThermoFisher | Any | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Centrifuge | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Counting Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Neural Basal-A Medium | Invitrogen | 10888-022 | |
| B27 | Invitrogen | 17404-044 | |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15070 | |
| L- Glutamine | Gibco | 25030 | |
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |
| F12 | Invitrogen | 12700075 | |
| 30% Glucose | Sigma | G6152 | 1M- 9.01g in 100mL dH2O |
| 1M Glucose | |||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | 155mM- 1.30g in 100mL dH2O |
| 155mM NaHCO3 | |||
| 1M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g in 100mL dH2O |
| Apo-Transferrin | R&D Systems | 3188-AT | |
| Putrescine | Sigma | P7505 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Selenium | Sigma | S9133 | |
| Progesterone | Sigma | P6149 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | 1 vial of papain can be used for 2 samples |
| Epidermal Growth Factor | Invitrogen | PMG8041 | Powder reconstituted with 1mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer |
| Fibroblast Growth Factor | Invitrogen | PHG0226 | Powder reconstituted with 0.5mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | In House | ||
| Trypan Blue | |||
| Hemocytometer | |||
| 24 well Plates | NUNC | ||
| 2M NaCl | Sigma | S5886 | 11.69g in 100mL dH2O |
| 1M KCL | Sigma | P5405 | 7.46g in 100mL dH2O |
| 1M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33g in 100mL dH2O |
| 108mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59g in 100mL dH2O |
References
- Johansson, C. B., et al. Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system. Cell. 96 (1), 25-34 (1999).
- McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276 (5309), 66-71 (1997).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), 1433-1438 (2000).
- Temple, S., Alvarez-Buylla, A. Stem cells in the adult mammalian central nervous system. Current Opinion in Neurology. 9 (1), 135-141 (1999).
- Zhang, R., et al. Activated neural stem cells contribute to stroke-induced neurogenesis and neuroblast migration toward the infarct boundary in adult rats. Journal Of Cerebral Blood Flow And Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).
- Komitova, M., Mattsson, B., Johansson, B. B., Eriksson, P. S. Enriched environment increases neural stem/progenitor cell proliferation and neurogenesis in the subventricular zone of stroke-lesioned adult rats. Stroke. 36 (6), 1278-1282 (2005).
- Faiz, M., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone give rise to reactive astrocytes in the cortex after stroke. Cell Stem Cell. 17 (5), 624-634 (2015).
- Ren, Y., et al. Ependymal cell contribution to scar formation after spinal cord injury is minimal, local and dependent on direct ependymal injury. Science Reports – UK. 7, (2017).
- Mothe, A. J., Tator, C. H. Proliferation, migration, and differentiation of endogenous ependymal region stem/progenitor cells following minimal spinal cord injury in the adult rat. Neuroscience. 131 (1), 177-187 (2005).
- Thuret, S., Moon, L. D., Gage, F. H. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nature Reviews Neuroscience. 7 (8), 628-643 (2006).
- Bethea, J. R., et al. Systemically administered interleukin-10 reduces tumor necrosis factor-alpha production and significantly improves functional recovery following traumatic spinal cord injury in rats. Journal of Neurotrauma. 16 (10), 851-863 (1999).
- Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 209 (2), 378-388 (2008).
- Cummings, B. J., et al. Human neural stem cells differentiate and promote locomotor recovery in spinal cord-injured mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (39), 14069-14074 (2005).
- Beattie, M. S., Hermann, G. E., Rogers, R. C., Bresnahan, J. C. Cell death in models of spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 37-47 (2002).
- Metz, G. A., et al. Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).
- Faulkner, J. R., et al. Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 24 (9), 2143-2155 (2004).
- Cheriyan, T., et al. Spinal cord injury models: a review. Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).
- Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay. Neural Cell Transplantation: Methods and Protocols. , 91-101 (2009).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nature Methods. 3 (10), (2006).
- Mignone, J. L., Kukekov, V., Chiang, A. S., Steindler, D., Enikolopov, G. Neural stem and progenitor cells in nestin-GFP transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 469 (3), 311-324 (2004).
- Xu, W., et al. Myelin basic protein regulates primitive and definitive neural stem cell proliferation from the adult spinal cord. Stem Cells. 35 (2), 485-496 (2017).
- Sachewsky, N., et al. Primitive neural stem cells in the adult mammalian brain give rise to GFAP-expressing neural stem cells. Stem Cell Reports. 2 (6), 810-824 (2014).
- Mothe, A., Tator, C. H. Isolation of neural stem/progenitor cells from the periventricular region of the adult rat and human spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
- Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Xiong, L., et al. Preconditioning with isoflurane produces dose-dependent neuroprotection via activation of adenosine triphosphate-regulated potassium channels after focal cerebral ischemia in rats. Anesthesia and Analgesia. 96 (1), 233-237 (2003).
- Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats. Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).
- Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
