الفحص نيوروسفيري لتقييم تنشيط الخلايا الجذعية العصبية الذاتية في نموذج الفأر من إصابات النخاع الشوكي الحد الأدنى
Summary
هنا، علينا أن نظهر أداء نموذج إصابة الحبل الشوكي الحد الأدنى في ماوس الكبار أن قطع الغيار مكانة القناة الوسطى السكن الذاتية العصبية الخلايا الجذعية (الود). علينا إظهار كيف يمكن استخدام التحليل نيوروسفيري التحديد الكمي للتنشيط والهجرة من الود البدائية ونهائية بعد الإصابة.
Abstract
هي الخلايا الجذعية العصبية (الود) في الحبل الشوكي الثدييات الكبار سكان هادئة نسبيا ميتوتيكالي تلين الخلايا التي يمكن دراستها في المختبر باستخدام الإنزيم نيوروسفيري. هذا الفحص تشكيل مستعمرة أداة قوية لدراسة استجابة الود للعوامل الخارجية في صحن؛ ومع ذلك، هذا يمكن أيضا لدراسة التأثير في فيفو التلاعب مع الفهم الصحيح لمواطن القوة والقيود المفروضة المقايسة. أحد التلاعب بالفائدة السريرية هو تأثير الإصابة على تفعيل مجلس الأمن القومي الذاتية. توفر النماذج الحالية لإصابات النخاع الشوكي تحديا لدراسة هذا حسب شدة النماذج شيوعاً كدمة وضغط ترانسيكشن تتسبب في تدمير مكانة مجلس الأمن القومي في موقع الإصابة التي يقيم فيها الخلايا الجذعية. وهنا يصف لنا نموذج الحد أدنى من ضرر الذي يتسبب في أضرار المترجمة على السطح dorsolateral سطحية من انخفاض مستوى الصدر (T7/8) على الحبل الشوكي الماوس الكبار. هذا النموذج الإصابة قطع غيار القناة الوسطى على مستوى الإصابة ويسمح تحليل الود التي تتواجد على مستوى الآفة في نقاط زمنية مختلفة بعد الإصابة. هنا، نحن إظهار كيف يمكن استخدام التحليل نيوروسفيري لدراسة تفعيل السكان متميزة، وذات الصلة منحدرين، اثنين من الود التي تتواجد في منطقة تلين النخاع الشوكي-الود البدائية ونهائي (بنسكس ودنسكس، على التوالي). ونحن لشرح كيفية عزل وثقافة هذه الود من منطقة تلين على مستوى الإصابة وموقع الإصابة المسألة الأبيض. لدينا تشريح النخاع الشوكي بعد الجراحة تظهر زيادة في إعداد بنسك والمستمدة من دنسك نيوروسفيريس من منطقة تلين الاحبال المصابين مقارنة بضوابط، متحدثاً عن التنشيط عن طريق الإصابة. وعلاوة على ذلك، في أعقاب الإصابة، المستمدة من دنسك نيوروسفيريس يمكن أن تكون معزولة من موقع الإصابة، مما يدل على قدرة الود لترحيل من مكانها تلين إلى مواقع الإصابة.
Introduction
يحتوي الجهاز العصبي المركزي يتدنى لتجديد ذاتي، مولتيبوتينت من الخلايا الجذعية التي لها القدرة على أن تؤدي إلى جميع الخلايا العصبية الناضجة مختلف أنواع1،2،3،4. هذه الخلايا الجذعية العصبية (الود) الموجودة في المنافذ المتخصصة في المخ والحبل الشوكي ويمكن تفعيلها بعد إصابة تتكاثر وتهاجر، وتفرق في الخلايا العصبية الناضجة. قد ثبت الود وذرياتهم إلى الهجرة إلى موقع الإصابة في الإصابات القشرية نماذج5،6. في الدماغ، وأظهرت الود لترحيل من البطينات الجانبية إلى موقع الإصابة حيث أنها تفرق في أستروسيتيس التي تسهم في تشكيل ندبة الدبقية7. في الحبل الشوكي، ومع ذلك، يفعل دراسات قليلة لاسال إذا كانت هذه نفس الود الذاتية يمكن تسخيرها لتعزيز الانتعاش بعد إصابة الحبل الشوكي. وفي الواقع، هناك حاليا نقاش بشأن ما إذا كان يتطلب التنشيط تجمع الخلايا الجذعية في الحبل الشوكي أضرار مادية مباشرة من مكانة تلين بطانة القناة الوسطى8 أو إذا كانت الأضرار التي لحقت العمود الفقري الحبل حمة (ترك الساق خلية مكانة سليمة) غير كافية لتنشيط الذاتية الود9.
استخدمت عدد من نماذج الإصابة (علوم) الحبل الشوكي لدراسة الفيزيولوجيا المرضية للإصابات الحادة والمزمنة. كما استخدمت هذه النماذج لاختبار العلاجات الممكنة لعلاج الخيال العلمي من خلال نيوروبروتيكتيون والمرباة والنامية خلية زرع/استبدال استراتيجيات10،،من1113. النماذج الحالية تشمل الإصابات ضغط و/أو كدمة، مما يتسبب في عجز وظيفي على نطاق واسع، فضلا عن الآفات واسعة و cavitations في سلك14،15. ندوب الدبقية الناتجة يمكن أن تمتد عبر عدة قطاعات العمود الفقري جنبا إلى جنب مع أغلبية العرض/محيط النخاع الشوكي16. وهكذا، بينما هذه النماذج ذات الصلة سريرياً، أنها تحمل تحديات كبيرة لدراسة رد الود الذاتية بعد الإصابة. وهناك نماذج كيميائية من الإصابات التي يمكن تكييفها ليسبب أشكالاً أكثر اعتدالا من الإصابات التي يمكن أن تدخر القناة الوسطى17. بيد هذه الأنواع من الإصابات التركيز على ديميليناتيون المرتبطة بالعلوم وليست نماذج ذات الصلة سريرياً عن الأضرار المادية و/أو الميكانيكية المرتبطة بالصدمة عشر
لمعالجة أوجه قصور نماذج الإصابة الحالية، أننا قد تكيفت إبرة مسار الحد أدنى علوم نموذجا، وضعت أصلاً في الفئران9، لتطبيق نموذج ماوس الكبار. يمكن إنشاء آفة متسقة من منطقة دورسولاتيرال في الحبل الشوكي الماوس نموذجنا إصابة تكييف وقطع الغيار القناة الوسطى في مستوى (مستويات) للإصابة. وميزة هذا النموذج أن ذلك يسمح بدراسة حركية مجلس الأمن القومي بعد الإصابة وهجرتها شعاعي المحتملة إلى موقع الإصابة. استخدام نموذج الماوس أيضا يسمح باستخدام الفئران المعدلة وراثيا التي تتيح تتبع النسب من الود الذاتية وذرياتهم بعد الإصابة. ويمكن كذلك تقييم خصائص الود باستخدام صيغة معدلة في المختبر نيوروسفيري التحليل التي يتم تقديمها في هذا البروتوكول.
تحليل نيوروسفيري هو في المختبر تشكيل مستعمرة مقايسة تسمح بعزل الود حضور ميتوجينس. في كثافة الطلاء الاستنساخ، تتكاثر الود الفردية إلى نشوء مستعمرات كروية التعويم الحر للخلايا التي تتكون من يتدنى صغيرة من الود وغالبية العظمى من فروعه18،19. لدينا بروتوكول، نبدي عزل اثنين من الود متميزة، وذات الصلة منحدرين من منطقة تلين النخاع الشوكي – تحت ظروف خط الأساس، وفي أعقاب نموذجنا علوم الحد الأدنى. وقف نيستين إكسبرس الخلايا (دنسكس) والبروتين حمضية فيبريلاري الدبقية (توصيني) نهائي العصبية وتزرع حضور عامل نمو البشرة (مماثلة) وعامل النمو تنتجها الخلايا الليفية (صندوق الأجيال القادمة) والهيبارين (يطلق عليها معا EFH)20. هذه دنسكس نادرة في الحبل الشوكي ساذج، مما أدى إلى نيوروسفيريس قليلة جداً في المختبر. ومع ذلك، نعرض أن دنسكس يتم تنشيطها بعد علوم الدنيا، توسيع عدد نيوروسفيريس معزولة عن منطقة المحيط بالبطينات21. الخلايا البدائية العصبية (بنسكس) المنبع دنسكس في نسب الخلايا الجذعية العصبية. بنسكس نادرة جداً، والتعبير عن مستويات منخفضة من علامة بلوريبوتينسي Oct4، وهي سرطان الدم استجابة العوامل المثبطة (LiF)22. ولا تشكل بنسكس نيوروسفيريس عندما المعزولة من النخاع الشوكي الماوس الكبار بسبب وجود البروتين الأساسية (MBP) المايلين في الثقافات الأولية؛ بيد أن نيوروسفيريس بنسك يمكن أن تكون معزولة من الفئران MBP ناقصة وإعدادهم الإصابات التالية الموسعة – شبيه دنسكس21. وأخيراً، نحن إظهار أن المستمدة من دنسك نيوروسفيريس يمكن أن تكون معزولة من موقع الإصابة في أوائل الأوقات بعد عشر الحد الأدنى وتبين هذه النتائج أن لدينا نموذج الضرر وفحوصات يمكن تقييم خصائص التنشيط تلين الود مثل قدرتها على تتكاثر وتهاجر في الاستجابة للإصابة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وخلال العملية الجراحية، وهناك بضع خطوات حاسمة حيث أن الباحث ينبغي أن تولي اهتماما خاصا لبغية الحصول على نتائج أفضل وتقليل التباين بين الحيوانات. يجب الحرص مع التخدير استنشاق (إيسوفلوراني) أثناء الجراحة كالمخدر قد ثبت أن لها آثار محصن مع التعرض لفترة طويلة27. وبناء على ذلك، عند…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هو تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة كريمبيل (منحة تشغيلية CMM). وكان WX جائزة الطالب “كارلتون مارغريت سميث”. NL حصل “منحة الدراسات العليا أونتاريو”.
Materials
| Agricola Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
| Moria Vannas-Wolff Spring Scissors (Curved) | Fine Science Tools | 15370-50 | Customize when ordering to get blunted tips |
| Graefe Forceps (Straight, 1×2 Teeth) | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Extra Fine Graefe Forceps (Curved, Serrated) | Fine Science Tools | 11152-10 | Or any other forceps for suturing |
| Hartman Hemostats (Straight) | Fine Science Tools | 13002-10 | Or any other appropriate for suturing |
| Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Or any other appropriate |
| Hair clippers | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA | or any other appropriate |
| Stereotaxic instrument | Stoeling | 51500 | or any other appropriate |
| Buprenorphine | or any appropirate sanctioned my animal care facility | ||
| Meloxicam | or any appropriate sanctioned by animal care facility | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE | or any other appropriate |
| Isoflurane | Baxter International Inc | DIN 02225875 | or any other appropriate for anesthesia |
| Q-tips Cottom Swabs | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS | |
| Cotton Gauze | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| 30G Needles | Becton Dickinson | 305106 | For Injury |
| 25G Needles | Becton Dickinson | 305122 | For Drug injections |
| 1mL Syringes | Becton Dickinson | 3090659 | for drug injections |
| 3mL Syringes | Becton Dickinson | 309657 | for fluid injections |
| 4-0 Suture | uoftmedstore.com | 2297-VS881 | for skin suturing |
| 6-0 Suture | uoftmedstore.com | VS889 | for muscle suturing |
| Polysporin ointment | amazon.ca | 102051 | |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 901806 | |
| 15mL conical tubes | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Petri Dishes | ThermoFisher | any appropriate | |
| Trypan Blue | ThermoFisher | Any | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Centrifuge | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Counting Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Neural Basal-A Medium | Invitrogen | 10888-022 | |
| B27 | Invitrogen | 17404-044 | |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15070 | |
| L- Glutamine | Gibco | 25030 | |
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |
| F12 | Invitrogen | 12700075 | |
| 30% Glucose | Sigma | G6152 | 1M- 9.01g in 100mL dH2O |
| 1M Glucose | |||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | 155mM- 1.30g in 100mL dH2O |
| 155mM NaHCO3 | |||
| 1M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g in 100mL dH2O |
| Apo-Transferrin | R&D Systems | 3188-AT | |
| Putrescine | Sigma | P7505 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Selenium | Sigma | S9133 | |
| Progesterone | Sigma | P6149 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | 1 vial of papain can be used for 2 samples |
| Epidermal Growth Factor | Invitrogen | PMG8041 | Powder reconstituted with 1mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer |
| Fibroblast Growth Factor | Invitrogen | PHG0226 | Powder reconstituted with 0.5mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | In House | ||
| Trypan Blue | |||
| Hemocytometer | |||
| 24 well Plates | NUNC | ||
| 2M NaCl | Sigma | S5886 | 11.69g in 100mL dH2O |
| 1M KCL | Sigma | P5405 | 7.46g in 100mL dH2O |
| 1M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33g in 100mL dH2O |
| 108mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59g in 100mL dH2O |
References
- Johansson, C. B., et al. Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system. Cell. 96 (1), 25-34 (1999).
- McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276 (5309), 66-71 (1997).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), 1433-1438 (2000).
- Temple, S., Alvarez-Buylla, A. Stem cells in the adult mammalian central nervous system. Current Opinion in Neurology. 9 (1), 135-141 (1999).
- Zhang, R., et al. Activated neural stem cells contribute to stroke-induced neurogenesis and neuroblast migration toward the infarct boundary in adult rats. Journal Of Cerebral Blood Flow And Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).
- Komitova, M., Mattsson, B., Johansson, B. B., Eriksson, P. S. Enriched environment increases neural stem/progenitor cell proliferation and neurogenesis in the subventricular zone of stroke-lesioned adult rats. Stroke. 36 (6), 1278-1282 (2005).
- Faiz, M., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone give rise to reactive astrocytes in the cortex after stroke. Cell Stem Cell. 17 (5), 624-634 (2015).
- Ren, Y., et al. Ependymal cell contribution to scar formation after spinal cord injury is minimal, local and dependent on direct ependymal injury. Science Reports – UK. 7, (2017).
- Mothe, A. J., Tator, C. H. Proliferation, migration, and differentiation of endogenous ependymal region stem/progenitor cells following minimal spinal cord injury in the adult rat. Neuroscience. 131 (1), 177-187 (2005).
- Thuret, S., Moon, L. D., Gage, F. H. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nature Reviews Neuroscience. 7 (8), 628-643 (2006).
- Bethea, J. R., et al. Systemically administered interleukin-10 reduces tumor necrosis factor-alpha production and significantly improves functional recovery following traumatic spinal cord injury in rats. Journal of Neurotrauma. 16 (10), 851-863 (1999).
- Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 209 (2), 378-388 (2008).
- Cummings, B. J., et al. Human neural stem cells differentiate and promote locomotor recovery in spinal cord-injured mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (39), 14069-14074 (2005).
- Beattie, M. S., Hermann, G. E., Rogers, R. C., Bresnahan, J. C. Cell death in models of spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 37-47 (2002).
- Metz, G. A., et al. Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).
- Faulkner, J. R., et al. Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 24 (9), 2143-2155 (2004).
- Cheriyan, T., et al. Spinal cord injury models: a review. Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).
- Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay. Neural Cell Transplantation: Methods and Protocols. , 91-101 (2009).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nature Methods. 3 (10), (2006).
- Mignone, J. L., Kukekov, V., Chiang, A. S., Steindler, D., Enikolopov, G. Neural stem and progenitor cells in nestin-GFP transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 469 (3), 311-324 (2004).
- Xu, W., et al. Myelin basic protein regulates primitive and definitive neural stem cell proliferation from the adult spinal cord. Stem Cells. 35 (2), 485-496 (2017).
- Sachewsky, N., et al. Primitive neural stem cells in the adult mammalian brain give rise to GFAP-expressing neural stem cells. Stem Cell Reports. 2 (6), 810-824 (2014).
- Mothe, A., Tator, C. H. Isolation of neural stem/progenitor cells from the periventricular region of the adult rat and human spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
- Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Xiong, L., et al. Preconditioning with isoflurane produces dose-dependent neuroprotection via activation of adenosine triphosphate-regulated potassium channels after focal cerebral ischemia in rats. Anesthesia and Analgesia. 96 (1), 233-237 (2003).
- Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats. Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).
- Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
