Burada, sahne ve koku doku Drosophila türlerden geliştirme incelemek için bir protokol mevcut. Disseke doku daha sonra kantitatif RT-PCR (Ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu) veya (RNAseq), sıralama RNA gibi moleküler analizleri için in vivo analizleri immünhistokimya veya in situ gibi yanı sıra kullanılabilir hibridizasyon.
Gelişimsel Nörobiyoloji, sistemleri neuroscience, yanı sıra Nörofizyoloji, davranış ve davranışsal evrim Drosophila koku alma sistemi yaygın olarak kullanılan bir sistemdir. Drosophila koku doku uçucu kimyasal cues hidro ve termo duyusal sinir hücreleri ek olarak algılayan koku reseptör nöronlar (ORNs) ev. Bu protokol için yetişkin Drosophila türlerin periferik koku doku geliştirme diseksiyon açıklar. İlk aşama ve Drosophila larva, antennal disk diseksiyon tarafından erken pupa aşamaları, orta-pupa aşamaları ve yetişkin anten diseksiyon tarafından takip ardından yaş nasıl açıklar. Ayrıca nerede hazırlıklar qRT-PCR, RNAseq veya immünhistokimya RNA ayıklama gibi moleküler teknikleri kullanılabilir yöntemleri gösterir. Bu yöntemler aynı zamanda diğer Drosophila türler species-specific pupa geliştirme sürelerinin ve ilgili aşamaları için uygun yaşlanma hesaplanır sonra uygulanabilir.
Gelişimsel Nörobiyoloji, sistemleri neuroscience, yanı sıra Nörofizyoloji, davranış çalışmalar ve davranışsal evrim1,2,3 Drosophila koku alma sistemi yaygın olarak kullanılan bir sistemdir, 4. Drosophila koku dokulara ek olarak hidro ve termo duyusal sinir hücreleri1,5,6uçucu kimyasal ipuçlarını bulmak koku reseptör nöronlar (ORNs) ev. Bu makale genel amacı nasıl sahne ve pupa ve yetişkin koku doku Drosophila türlerin geliştirme incelemek için göstermektir. Örnekleri farklı pupa aşamaları moleküler ve gelişimsel analizleri gibi RNAseq ve kantitatif RT-PCR, periferik koku sistem ayrıca teknikleri etiketleme vivo içinde doku oluşturmak için bu tekniği için mantığı olduğunu . Bu teknik özellikle gelişmekte olan yetişkin koku alma sistemi belirli hücre türünün tüm transgenik reaktifler var mı non –Drosophila melanogaster türlerden transkripsiyon profilleri dinamikleri tanımlamak yararlı olabilir etiketleme ve analizler. Bu makale, antennal diskler ve antenler pupa ve yetişkin Drosophila türlerden incelemek nasıl gösterir. İlk olarak, Drosophila puparium oluşumu (APF, beyaz pupa veya prepupae) gelişimsel evreleme ve species-specific yaşlanma için 0 h tanımlamak nasıl gösterir. Ardından, antennal diskler ve üçüncü antennal segment incelemek nasıl gösterir; Özellikle, nasıl onları göz disk ve ikinci antennal segment RNAseq veya RT-PCR için gereken doku saflık için ayırmak için. Bu protokol için kabaca açıklanan D. melanogaster aşamada önceden desenli antennal disk (prepupae) karşılık, öncüleri antennal üzerinden yelpazesi disk (8 h APF), ORNs (40 h APF), için terminal farklılaşma başlangıcı ve Yetişkin anten. Son olarak, örnek bir kantitatif RT-PCR için yetişkin anten istimal belgili tanımlık yöntem izole ve in vivo immünhistokimya için veriyoruz. Bu yöntem örnekleri bir RNA/DNA analizi ve koku dokulardan periferik Drosophila tür geliştirme immünhistokimya oluşturmak için kullanılabilir.
Bu iletişim kuralı labs Drosophila Drosophila koku doku, hem de karşılaştırmalı analizi, bu programların geliştirilmesinde çalışma genetik ve transkripsiyon programları belirlenmesinde baktılar için yararlı bir kaynaktır bir tür. Gelecekteki çalışmaları için bir astar olarak farklı gelişim aşamalarında sistemleri düzeyi transkripsiyon profillerden gerekirse özellikle yararlıdır. Burada açıklanan protokol sahne ve dört anahtar gelişimin koku alma sistemi üzerinden ön…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışmada, Ulusal Bilim Vakfı Hibe için Pelin C. Volkan (DEB-1457690) tarafından desteklenmiştir.
10X Phosphate-buffered Saline | Gibco | 70011-044 | Dilute to 1X in RNase free water |
CO2 tank | Air Gas | CD R200 | |
Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Trizol | Invitrogen | 15596-026 | RNA isolation solutions |
Dissecting Microscope | |||
Small bucket with ice | |||
P20 and P200 micropipettes and tips | |||
1.7 mL Microfuge tubes | Purchase nuclease free for best results | ||
0.2 mL PCR tubes | |||
Paraformaldehyde powder | Polysciences | 380 | |
10% Triton X-100 | Teknova | T1105 | Dilute to 0.2% v/v in 1X PBS |
2" petri dishes | |||
55mm filter paper | Whatman | 1001-055 | Wet with water and place in a petri dish to keep pupae moist |
25 C incubator | |||
deionized H2O | Purchase nuclease free or treat with DEPC | ||
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | to be used for making dissection pads from Terizaki plate covers. | |
MicroWell Mini Trays with lids | Nunc | 438733 | Lids can be used to make silicone dissection pads |
Rabbit anti-GFP antibody | MBL international corpor | PM005 | primary antibody |
Mouse anti RAT CD2 | AbD seroTec | MCA154RHDL | primary antibody |
ADL195 (anti lamin, mouse) | Dev studies hydoma ban | ADL195-s | primary antibody |
Alexa Fluor® 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | invitrogen | A11008 | Secondary antibody |
Cy3 Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | Secondary antibody |
Triton X-100, Protein Grade Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered | CALBIOCHEM | 648463 | detergent |
Lab Rotator | Thermo scientific | Rotator | |
Nuclease Free Water | Growcells.com | NUPW-0125 | Water |
Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | For cleaning dissection supplies |
Superscript II | invitrogen | 18064014 | Reverse Transcriptase |
QIAshredder (50) | RNA extraction | QIAGEN | 79654 |
Oligo(dT)12-18 Primer | RT | life technologies | 18418012 |
RNeasy MinElute Cleanup Kit (50) | RNA extraction | QIAGEN | 74204 |
FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN) | qPCR | Roche | 04913850001 |
FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER | qPCR | Roche | 06402712001 |
LIGHTCYCLER 480 – MULTIWELL PLATE 96 | qPCR | Roche | 04729692001 |
NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix | qPCR | NEB | M0541S |