Summary

Periferik koku doku için geliştirme hazırlanıyor moleküler ve immunohistokimyasal Drosophila analizde

Published: June 13, 2018
doi:

Summary

Burada, sahne ve koku doku Drosophila türlerden geliştirme incelemek için bir protokol mevcut. Disseke doku daha sonra kantitatif RT-PCR (Ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu) veya (RNAseq), sıralama RNA gibi moleküler analizleri için in vivo analizleri immünhistokimya veya in situ gibi yanı sıra kullanılabilir hibridizasyon.

Abstract

Gelişimsel Nörobiyoloji, sistemleri neuroscience, yanı sıra Nörofizyoloji, davranış ve davranışsal evrim Drosophila koku alma sistemi yaygın olarak kullanılan bir sistemdir. Drosophila koku doku uçucu kimyasal cues hidro ve termo duyusal sinir hücreleri ek olarak algılayan koku reseptör nöronlar (ORNs) ev. Bu protokol için yetişkin Drosophila türlerin periferik koku doku geliştirme diseksiyon açıklar. İlk aşama ve Drosophila larva, antennal disk diseksiyon tarafından erken pupa aşamaları, orta-pupa aşamaları ve yetişkin anten diseksiyon tarafından takip ardından yaş nasıl açıklar. Ayrıca nerede hazırlıklar qRT-PCR, RNAseq veya immünhistokimya RNA ayıklama gibi moleküler teknikleri kullanılabilir yöntemleri gösterir. Bu yöntemler aynı zamanda diğer Drosophila türler species-specific pupa geliştirme sürelerinin ve ilgili aşamaları için uygun yaşlanma hesaplanır sonra uygulanabilir.

Introduction

Gelişimsel Nörobiyoloji, sistemleri neuroscience, yanı sıra Nörofizyoloji, davranış çalışmalar ve davranışsal evrim1,2,3 Drosophila koku alma sistemi yaygın olarak kullanılan bir sistemdir, 4. Drosophila koku dokulara ek olarak hidro ve termo duyusal sinir hücreleri1,5,6uçucu kimyasal ipuçlarını bulmak koku reseptör nöronlar (ORNs) ev. Bu makale genel amacı nasıl sahne ve pupa ve yetişkin koku doku Drosophila türlerin geliştirme incelemek için göstermektir. Örnekleri farklı pupa aşamaları moleküler ve gelişimsel analizleri gibi RNAseq ve kantitatif RT-PCR, periferik koku sistem ayrıca teknikleri etiketleme vivo içinde doku oluşturmak için bu tekniği için mantığı olduğunu . Bu teknik özellikle gelişmekte olan yetişkin koku alma sistemi belirli hücre türünün tüm transgenik reaktifler var mı non –Drosophila melanogaster türlerden transkripsiyon profilleri dinamikleri tanımlamak yararlı olabilir etiketleme ve analizler. Bu makale, antennal diskler ve antenler pupa ve yetişkin Drosophila türlerden incelemek nasıl gösterir. İlk olarak, Drosophila puparium oluşumu (APF, beyaz pupa veya prepupae) gelişimsel evreleme ve species-specific yaşlanma için 0 h tanımlamak nasıl gösterir. Ardından, antennal diskler ve üçüncü antennal segment incelemek nasıl gösterir; Özellikle, nasıl onları göz disk ve ikinci antennal segment RNAseq veya RT-PCR için gereken doku saflık için ayırmak için. Bu protokol için kabaca açıklanan D. melanogaster aşamada önceden desenli antennal disk (prepupae) karşılık, öncüleri antennal üzerinden yelpazesi disk (8 h APF), ORNs (40 h APF), için terminal farklılaşma başlangıcı ve Yetişkin anten. Son olarak, örnek bir kantitatif RT-PCR için yetişkin anten istimal belgili tanımlık yöntem izole ve in vivo immünhistokimya için veriyoruz. Bu yöntem örnekleri bir RNA/DNA analizi ve koku dokulardan periferik Drosophila tür geliştirme immünhistokimya oluşturmak için kullanılabilir.

Protocol

Aşağıdaki iletişim kuralı Duke Üniversitesi Araştırma Etik Komitesi tarafından kurulan etik kuralları ile tutarlıdır. 1. doku hazırlık ve Drosophila melanogaster Pupa gelişimsel evreleme İlk olarak, ne kadar çok sinek diseksiyon için gerekli olacaktır tanımlamak. RT-PCR ve RNAseq için 100-200 antennal diskler ve anten prepupal, 8 h APF, 40 h APF ve yetişkin aşamalarında gerekli olan bireyler toplamak. İmmünhistokimya için 10-20 kişi incelemek.</li…

Representative Results

Disseke gelişmekte olan koku doku RT-PCR tarafından takip RNA çıkarılması için gen ekspresyonu değerlendirmek için kullanılabilir veya onun ifade deseni ve genler alt hücrede yerleşimi belirlemek için immünhistokimya iletişim kuralları üzerinden alınan faiz. Bu bölümde, her iki protokolden temsilcisi sonuçları sunmak. Şekil 1 temsilcisi kantitatif RT-yüzey hücre reseptörü ve koku reseptör Gen transkripsiyonu vahşi-türü yetişkin…

Discussion

Bu iletişim kuralı labs Drosophila Drosophila koku doku, hem de karşılaştırmalı analizi, bu programların geliştirilmesinde çalışma genetik ve transkripsiyon programları belirlenmesinde baktılar için yararlı bir kaynaktır bir tür. Gelecekteki çalışmaları için bir astar olarak farklı gelişim aşamalarında sistemleri düzeyi transkripsiyon profillerden gerekirse özellikle yararlıdır. Burada açıklanan protokol sahne ve dört anahtar gelişimin koku alma sistemi üzerinden ön…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışmada, Ulusal Bilim Vakfı Hibe için Pelin C. Volkan (DEB-1457690) tarafından desteklenmiştir.

Materials

10X Phosphate-buffered Saline Gibco 70011-044 Dilute to 1X in RNase free water
CO2 tank Air Gas CD R200
Two sharp forceps (Dumont #55) Fine Science Tools 11255-20
Trizol Invitrogen 15596-026 RNA isolation solutions
Dissecting Microscope
Small bucket with ice
P20 and P200 micropipettes and tips
1.7 mL Microfuge tubes Purchase nuclease free for best results
0.2 mL PCR tubes
Paraformaldehyde powder Polysciences 380
10% Triton X-100 Teknova T1105 Dilute to 0.2% v/v in 1X PBS
2" petri dishes
55mm filter paper Whatman 1001-055 Wet with water and place in a petri dish to keep pupae moist
25 C incubator
deionized H2O Purchase nuclease free or treat with DEPC
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning to be used for making dissection pads from Terizaki plate covers.
MicroWell Mini Trays with lids Nunc 438733 Lids can be used to make silicone dissection pads
Rabbit anti-GFP antibody MBL international corpor PM005 primary antibody
Mouse anti RAT CD2 AbD seroTec MCA154RHDL primary antibody
ADL195 (anti lamin, mouse) Dev studies hydoma ban ADL195-s primary antibody
Alexa Fluor® 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) invitrogen A11008 Secondary antibody
Cy3 Goat Anti-Mouse IgG Jackson ImmunoResearch 115-166-003 Secondary antibody
Triton X-100, Protein Grade Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered CALBIOCHEM 648463 detergent
Lab Rotator Thermo scientific Rotator
Nuclease Free Water Growcells.com NUPW-0125 Water
Light-Duty Tissue Wipers VWR 82003-822 For cleaning dissection supplies
Superscript II invitrogen 18064014 Reverse Transcriptase 
QIAshredder (50) RNA extraction QIAGEN 79654
Oligo(dT)12-18 Primer RT life technologies 18418012
RNeasy MinElute Cleanup Kit (50) RNA extraction QIAGEN 74204
FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN) qPCR Roche 04913850001
FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER  qPCR Roche 06402712001
LIGHTCYCLER 480 – MULTIWELL PLATE 96 qPCR Roche 04729692001
NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix qPCR NEB M0541S

References

  1. Barish, S., Volkan, P. C. Mechanisms of olfactory receptor neuron specification in Drosophila. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 4 (6), 609-621 (2015).
  2. Pan, J. W., Volkan, P. C. Mechanisms of development and evolution of the insect olfactory system. Cell and Developmental Biology. 2, 130 (2013).
  3. Ramdya, P., Benton, R. Evolving olfactory systems on the fly. Trends in Genetics. 26 (7), 307-316 (2010).
  4. Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).
  5. Knecht, Z. A., et al. Distinct combinations of variant ionotropic glutamate receptors mediate thermosensation and hygrosensation in Drosophila. eLife. 5, 44-60 (2016).
  6. Enjin, A., et al. Humidity sensing in Drosophila. Current Biology. 26 (10), 1352-1358 (2016).
  7. Li, Q., Barish, S., Okuwa, S., Volkan, P. C. Examination of endogenous rotund expression and function in developing Drosophila. olfactory system using CRISPR-Cas9-mediated protein tagging. G3: Genes|Genomes|Genetics. 5 (12), 2809-2816 (2015).
  8. Hueston, C. E., et al. Chromatin modulatory proteins and olfactory receptor signaling in the refinement and maintenance of fruitless expression in olfactory receptor neurons. PLoS Biology. 14 (4), 1002443 (2016).
  9. Li, Q., et al. Combinatorial rules of precursor specification underlying olfactory neuron diversity. Current Biology. 23 (24), 2481-2490 (2013).
  10. Li, Q., et al. A functionally conserved gene regulatory network module governing olfactory neuron diversity. PLoS Genetics. 12 (1), 1005780 (2016).
  11. Pan, J. W., et al. Patterns of transcriptional parallelism and variation in the developing olfactory system of Drosophila species. Scientific Reports. 7 (1), 8804 (2017).
  12. Pan, J. W., et al. Comparative analysis of behavioral and transcriptional variation underlying CO2 sensory neuron function and development in Drosophila. Fly. 11 (4), 239-252 (2017).
  13. Stern, D. L., et al. Genetic and transgenic reagents for Drosophila simulans, D. mauritiana, D. yakuba, D. santomea, and D. virilis. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (4), 1339-1347 (2017).

Play Video

Cite This Article
Barish, S., Volkan, P. C. Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila. J. Vis. Exp. (136), e57716, doi:10.3791/57716 (2018).

View Video