Préparer le développement de tissu olfactif périphérique pour moléculaire et analyse Immunohistochemical chez la drosophile
Summary
Nous présentons ici un protocole pour organiser et disséquer à développer le tissu olfactif des espèces de drosophile . Le tissu découpé peut ensuite être utilisé pour des analyses moléculaires, comme quantitative RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) ou l’ARN séquençage (RNAseq), ainsi que des analyses in vivo , comme immunohistochemistry ou in situ hybridation.
Abstract
Le système olfactif de la drosophile est un système largement utilisé dans la neurobiologie développementale, neurosciences des systèmes, ainsi que neurophysiologie, comportement et évolution comportementale. Des tissus de drosophile olfactifs maison les neurones récepteurs olfactifs (ORN) détectant les signaux chimiques volatils en plus des neurones hydro – et thermo-sensorielle. Dans ce protocole, nous décrivons la dissection de mettre au point des tissus périphériques olfactif de l’espèce de drosophile adulte. Tout d’abord, nous décrivons comment organiser et l’âge des larves de drosophile , suivies par la dissection du disque antennaire de premiers stades nymphales, suivies par la dissection des antennes des adultes et de milieu-pupal étapes. Nous montrons également les méthodes où les préparations doivent être utilisées dans les techniques moléculaires, tels que l’extraction de l’ARN pour qRT-PCR, RNAseq ou immunohistochimie. Ces méthodes peuvent également être appliquées à d’autres espèces de drosophile après temps de développement nymphal spécifique à l’espèce sont déterminés et stades respectifs sont calculés pour le vieillissement approprié.
Introduction
Le système olfactif de la drosophile est un système largement utilisé dans la neurobiologie développementale, neurosciences des systèmes, ainsi que neurophysiologie, études de comportement et évolution comportementale1,2,3, 4. Des tissus de drosophile olfactifs abritent les neurones récepteurs olfactifs (ORN) détectant les signaux chimiques volatils en plus de l’hydro – et thermo-sensorielle neurones1,5,6. L’objectif global de ce manuscrit est de démontrer comment organiser et disséquer développant des pupe et adult tissu olfactif chez les espèces de drosophile . La justification de cette technique consiste à produire des échantillons de différents stades nymphales analyses moléculaires et du développement du système olfactif périphérique, tels que RNAseq et RT-PCR quantitative, en outre à in vivo des tissus techniques de marquage . Cette technique peut être particulièrement utile pour identifier la dynamique des profils de transcriptionnelles dans le développement du système olfactif adult des espèces non –melanogaster de drosophile , qui n’ont pas tous les réactifs transgéniques pour le type de cellule spécifique labels et analyses. Dans ce manuscrit, nous démontrons comment disséquer les disques antennaires et antennes d’espèce Drosophila pupe et adulte. Tout d’abord, nous montrons comment identifier Drosophila 0 h de formation puparium (APF, nymphes blanches ou prénymphes) mise en scène du développement et du vieillissement spécifique à l’espèce. Ensuite, nous montrons comment disséquer les disques antennaires et le troisième segment antennaire ; plus précisément, comment les désolidariser le disque oculaire et l’antennaire deuxième pour la pureté de tissu nécessaire pour RNAseq ou RT-PCR. Les étapes chez d. melanogaster décrit dans le présent protocole, à peu près correspondent à des motif disque antennaire (prénymphes), la sélection des précurseurs de l’antennaire disc (8 h CSA), le début de la différenciation terminale pour Orn (40 h CSA), et antenne adulte. Enfin, nous donner des exemples pour une RT-PCR quantitative d’antennes adultes isolés à l’aide de la méthode et pour en vivo immunohistochemistry. Cette méthode peut être utilisée pour générer des échantillons pour l’analyse de l’ARN/ADN et immunohistochimie sur le développement des tissus périphériques olfactives provenant de différentes espèces de drosophile .
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole est une ressource utile pour les laboratoires intéressés d’identifier les programmes génétiques et transcriptionnelles opérant dans le développement de la drosophile tissu olfactif, en plus d’une analyse comparative de ces programmes à travers de la drosophile espèces. Il est particulièrement utile si les systèmes au niveau transcriptionnels profils de différentes étapes du développement sont nécessaires comme une amorce pour de futures études. Le protocole décrit ici il…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par une bourse de la National Science Foundation au Pelin C. Volkan (DEB-1457690).
Materials
| 10X Phosphate-buffered Saline | Gibco | 70011-044 | Dilute to 1X in RNase free water |
| CO2 tank | Air Gas | CD R200 | |
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | RNA isolation solutions |
| Dissecting Microscope | |||
| Small bucket with ice | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| 1.7 mL Microfuge tubes | Purchase nuclease free for best results | ||
| 0.2 mL PCR tubes | |||
| Paraformaldehyde powder | Polysciences | 380 | |
| 10% Triton X-100 | Teknova | T1105 | Dilute to 0.2% v/v in 1X PBS |
| 2" petri dishes | |||
| 55mm filter paper | Whatman | 1001-055 | Wet with water and place in a petri dish to keep pupae moist |
| 25 C incubator | |||
| deionized H2O | Purchase nuclease free or treat with DEPC | ||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | to be used for making dissection pads from Terizaki plate covers. | |
| MicroWell Mini Trays with lids | Nunc | 438733 | Lids can be used to make silicone dissection pads |
| Rabbit anti-GFP antibody | MBL international corpor | PM005 | primary antibody |
| Mouse anti RAT CD2 | AbD seroTec | MCA154RHDL | primary antibody |
| ADL195 (anti lamin, mouse) | Dev studies hydoma ban | ADL195-s | primary antibody |
| Alexa Fluor® 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | invitrogen | A11008 | Secondary antibody |
| Cy3 Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | Secondary antibody |
| Triton X-100, Protein Grade Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered | CALBIOCHEM | 648463 | detergent |
| Lab Rotator | Thermo scientific | Rotator | |
| Nuclease Free Water | Growcells.com | NUPW-0125 | Water |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | For cleaning dissection supplies |
| Superscript II | invitrogen | 18064014 | Reverse Transcriptase |
| QIAshredder (50) | RNA extraction | QIAGEN | 79654 |
| Oligo(dT)12-18 Primer | RT | life technologies | 18418012 |
| RNeasy MinElute Cleanup Kit (50) | RNA extraction | QIAGEN | 74204 |
| FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN) | qPCR | Roche | 04913850001 |
| FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER | qPCR | Roche | 06402712001 |
| LIGHTCYCLER 480 – MULTIWELL PLATE 96 | qPCR | Roche | 04729692001 |
| NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix | qPCR | NEB | M0541S |
References
- Barish, S., Volkan, P. C. Mechanisms of olfactory receptor neuron specification in Drosophila. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 4 (6), 609-621 (2015).
- Pan, J. W., Volkan, P. C. Mechanisms of development and evolution of the insect olfactory system. Cell and Developmental Biology. 2, 130 (2013).
- Ramdya, P., Benton, R. Evolving olfactory systems on the fly. Trends in Genetics. 26 (7), 307-316 (2010).
- Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).
- Knecht, Z. A., et al. Distinct combinations of variant ionotropic glutamate receptors mediate thermosensation and hygrosensation in Drosophila. eLife. 5, 44-60 (2016).
- Enjin, A., et al. Humidity sensing in Drosophila. Current Biology. 26 (10), 1352-1358 (2016).
- Li, Q., Barish, S., Okuwa, S., Volkan, P. C. Examination of endogenous rotund expression and function in developing Drosophila. olfactory system using CRISPR-Cas9-mediated protein tagging. G3: Genes|Genomes|Genetics. 5 (12), 2809-2816 (2015).
- Hueston, C. E., et al. Chromatin modulatory proteins and olfactory receptor signaling in the refinement and maintenance of fruitless expression in olfactory receptor neurons. PLoS Biology. 14 (4), 1002443 (2016).
- Li, Q., et al. Combinatorial rules of precursor specification underlying olfactory neuron diversity. Current Biology. 23 (24), 2481-2490 (2013).
- Li, Q., et al. A functionally conserved gene regulatory network module governing olfactory neuron diversity. PLoS Genetics. 12 (1), 1005780 (2016).
- Pan, J. W., et al. Patterns of transcriptional parallelism and variation in the developing olfactory system of Drosophila species. Scientific Reports. 7 (1), 8804 (2017).
- Pan, J. W., et al. Comparative analysis of behavioral and transcriptional variation underlying CO2 sensory neuron function and development in Drosophila. Fly. 11 (4), 239-252 (2017).
- Stern, D. L., et al. Genetic and transgenic reagents for Drosophila simulans, D. mauritiana, D. yakuba, D. santomea, and D. virilis. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (4), 1339-1347 (2017).
