Summary

הכנת לפתח רקמות היקפיים חוש הריח עבור מולקולרית וניתוח Immunohistochemical ב דרוזופילה

Published: June 13, 2018
doi:

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שלב ומנתחים לפתח חוש הריח רקמות ממינים דרוזופילה . הרקמה ביתור מאוחר יותר ניתן להשתמש עבור ניתוחים מולקולריים, כגון כמותיים RT-PCR (הפוך תמלול-תגובת שרשרת פולימראזית) או RNA רצף (RNAseq), כמו גם ניתוחים ויוו כגון אימונוהיסטוכימיה או בחיי עיר הכלאה.

Abstract

מערכת הריח של דרוזופילה הוא בשימוש נרחב מערכת הנוירו-ביולוגיה התפתחותית, מערכות neuroscience, כמו גם נוירופיזיולוגיה, התנהגות ו אבולוציה התנהגותית. רקמות חוש הריח דרוזופילה בית הנוירונים קולטני ריח (ORNs) לזהות סימנים כימיים נדיפים בנוסף הידרו – ו התרמו-החישה הניריונים. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את הקרע לפתח רקמות היקפיים חוש הריח של המין דרוזופילה למבוגרים. ראשית נתאר כיצד שלב גיל דרוזופילה הזחלים, ואחריה את הקרע של הדיסק antennal הגולמי בשלבים המוקדמים, ואחריה ניתוח מחושיהם שלבים אמצע-הגולמי ומבוגרים. אנו גם מראים שיטות שבו ההכנות יכול להיות מנוצל טכניקות מולקולריות, כגון החילוץ RNA לרביעיית-PCR, RNAseq או אימונוהיסטוכימיה. שיטות אלה ניתן להחיל גם למינים אחרים דרוזופילה לאחר פיתוח הגולמי תלויי מין פעמים נקבעים, בשלבים המתאימים מחושבים להזדקנות המתאים.

Introduction

מערכת הריח של דרוזופילה הוא מערכת הנפוצה הנוירו-ביולוגיה התפתחותית, מערכות neuroscience, כמו גם נוירופיזיולוגיה, לימודי התנהגות ו אבולוציה התנהגותית1,2,3, 4. רקמות חוש הריח דרוזופילה בית הנוירונים קולטני ריח (ORNs) לזהות סימנים כימיים נדיפים בנוסף הידרו – ו התרמו-החישה הניריונים1,5,6. המטרה הכוללת של כתב יד זה הוא כדי להדגים כיצד שלב ומנתחים לפתח רקמות חוש הריח הגולמי ומבוגרים במינים דרוזופילה . הרציונל של טכניקה זו היא כדי ליצור דוגמאות מתוך שלבים שונים הגולמי עבור ניתוחים התפתחותית המולקולריים של מערכת הריח היקפיים, כגון RNAseq ו- RT-PCR כמותי, בנוסף ויוו רקמת תיוג טכניקות . טכניקה זו יכולה להיות שימושית במיוחד לזהות את הדינמיקה של פרופילים תעתיק במערכת בפיתוח חוש הריח למבוגרים מן הלא –melanogaster דרוזופילה מינים, אשר אין כל ריאגנטים הטרנסגניים עבור סוג התא הספציפי תיוג וניתוחים. כתב יד זה, נדגים כיצד לנתח דיסקים antennal ומחושים ממינים דרוזופילה הגולמי ומבוגרים. ראשית, אנו מראים כיצד לזהות דרוזופילה הו היווצרות puparium (APF, גלמים לבנים או prepupae) עבור הזמני התפתחותית והזדקנות ספציפית. בשלב הבא, אנו מציגים כיצד לנתח דיסקים antennal ו- antennal המגזר השלישי; באופן ספציפי, כיצד לבטל אותם מן העין דיסק קטע antennal שני טוהר רקמת RNAseq או RT-מותני. שלבי ד melanogaster שמתואר פרוטוקול זה בערך שיתאימו הדיסק antennal בדוגמת מראש (prepupae), הבחירה של סימנים מקדימים של antennal דיסק (8 שעות APF), ההתחלה של בידול מסוף עבור ORNs (40 h APF), ו אנטנה למבוגרים. בסופו של דבר, אנחנו נותנים דוגמאות עבור RT-PCR כמותי של אנטנות למבוגרים מבודדים בשיטת, ובשביל ויוו אימונוהיסטוכימיה. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי ליצור דוגמאות עבור ניתוח RNA/DNA, אימונוהיסטוכימיה על פיתוח רקמות היקפיים חוש הריח של מינים שונים דרוזופילה .

Protocol

פרוטוקול הבאים הוא תואם ההנחיות האתיקה שנקבעו על-ידי ועדת האתיקה של המחקר באוניברסיטת דיוק. 1. רקמות והכנה הזמני התפתחותית של גולם דרוזופילה melanogaster ראשית, עליך לזהות כמה זבובים יהיה צורך הקרע. RT-PCR, RNAseq, לאסוף 100-200 דיסקים antennal אנטנות מאנשים אשר נחוצים בשלבים prepupal, 8 ש…

Representative Results

הרקמה ביתור חוש הריח המתפתח יכול לשמש לחילוץ RNA ואחריו RT-PCR כדי להעריך ביטוי גנים או יכול להיתפס באמצעות פרוטוקולים אימונוהיסטוכימיה כדי לקבוע את דפוס הביטוי שלו, לוקליזציה תת הסלולר של הגנים של ריבית. בחלק זה, אנו מציגים תוצאות נציג או פרוטוקול. איור 1 הוא …

Discussion

פרוטוקול זה הוא משאב שימושי עבור מעבדות מעוניין לזהות את גנטי תעתיק ותוכניות הפעלה בפיתוח דרוזופילה רקמות חוש הריח, כמו גם ניתוח השוואתי של תוכניות אלה על פני דרוזופילה מינים. זה שימושי במיוחד אם מערכות ברמת פרופילים תעתיק של שלבים התפתחותיים שונים נדרשים בתור פריימר עבור מחקרי…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מענק של הקרן הלאומית למדע כדי Pelin ג וולקן (דב-1457690).

Materials

10X Phosphate-buffered Saline Gibco 70011-044 Dilute to 1X in RNase free water
CO2 tank Air Gas CD R200
Two sharp forceps (Dumont #55) Fine Science Tools 11255-20
Trizol Invitrogen 15596-026 RNA isolation solutions
Dissecting Microscope
Small bucket with ice
P20 and P200 micropipettes and tips
1.7 mL Microfuge tubes Purchase nuclease free for best results
0.2 mL PCR tubes
Paraformaldehyde powder Polysciences 380
10% Triton X-100 Teknova T1105 Dilute to 0.2% v/v in 1X PBS
2" petri dishes
55mm filter paper Whatman 1001-055 Wet with water and place in a petri dish to keep pupae moist
25 C incubator
deionized H2O Purchase nuclease free or treat with DEPC
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning to be used for making dissection pads from Terizaki plate covers.
MicroWell Mini Trays with lids Nunc 438733 Lids can be used to make silicone dissection pads
Rabbit anti-GFP antibody MBL international corpor PM005 primary antibody
Mouse anti RAT CD2 AbD seroTec MCA154RHDL primary antibody
ADL195 (anti lamin, mouse) Dev studies hydoma ban ADL195-s primary antibody
Alexa Fluor® 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) invitrogen A11008 Secondary antibody
Cy3 Goat Anti-Mouse IgG Jackson ImmunoResearch 115-166-003 Secondary antibody
Triton X-100, Protein Grade Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered CALBIOCHEM 648463 detergent
Lab Rotator Thermo scientific Rotator
Nuclease Free Water Growcells.com NUPW-0125 Water
Light-Duty Tissue Wipers VWR 82003-822 For cleaning dissection supplies
Superscript II invitrogen 18064014 Reverse Transcriptase 
QIAshredder (50) RNA extraction QIAGEN 79654
Oligo(dT)12-18 Primer RT life technologies 18418012
RNeasy MinElute Cleanup Kit (50) RNA extraction QIAGEN 74204
FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN) qPCR Roche 04913850001
FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER  qPCR Roche 06402712001
LIGHTCYCLER 480 – MULTIWELL PLATE 96 qPCR Roche 04729692001
NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix qPCR NEB M0541S

References

  1. Barish, S., Volkan, P. C. Mechanisms of olfactory receptor neuron specification in Drosophila. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 4 (6), 609-621 (2015).
  2. Pan, J. W., Volkan, P. C. Mechanisms of development and evolution of the insect olfactory system. Cell and Developmental Biology. 2, 130 (2013).
  3. Ramdya, P., Benton, R. Evolving olfactory systems on the fly. Trends in Genetics. 26 (7), 307-316 (2010).
  4. Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).
  5. Knecht, Z. A., et al. Distinct combinations of variant ionotropic glutamate receptors mediate thermosensation and hygrosensation in Drosophila. eLife. 5, 44-60 (2016).
  6. Enjin, A., et al. Humidity sensing in Drosophila. Current Biology. 26 (10), 1352-1358 (2016).
  7. Li, Q., Barish, S., Okuwa, S., Volkan, P. C. Examination of endogenous rotund expression and function in developing Drosophila. olfactory system using CRISPR-Cas9-mediated protein tagging. G3: Genes|Genomes|Genetics. 5 (12), 2809-2816 (2015).
  8. Hueston, C. E., et al. Chromatin modulatory proteins and olfactory receptor signaling in the refinement and maintenance of fruitless expression in olfactory receptor neurons. PLoS Biology. 14 (4), 1002443 (2016).
  9. Li, Q., et al. Combinatorial rules of precursor specification underlying olfactory neuron diversity. Current Biology. 23 (24), 2481-2490 (2013).
  10. Li, Q., et al. A functionally conserved gene regulatory network module governing olfactory neuron diversity. PLoS Genetics. 12 (1), 1005780 (2016).
  11. Pan, J. W., et al. Patterns of transcriptional parallelism and variation in the developing olfactory system of Drosophila species. Scientific Reports. 7 (1), 8804 (2017).
  12. Pan, J. W., et al. Comparative analysis of behavioral and transcriptional variation underlying CO2 sensory neuron function and development in Drosophila. Fly. 11 (4), 239-252 (2017).
  13. Stern, D. L., et al. Genetic and transgenic reagents for Drosophila simulans, D. mauritiana, D. yakuba, D. santomea, and D. virilis. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (4), 1339-1347 (2017).

Play Video

Cite This Article
Barish, S., Volkan, P. C. Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila. J. Vis. Exp. (136), e57716, doi:10.3791/57716 (2018).

View Video