Preparando a desenvolver tecido olfativo periférico para Molecular e análise imuno-histoquímica em Drosophila

O sistema olfativo de Drosophila é um sistema amplamente utilizado em neurobiologia do desenvolvimento, neurociência de sistemas, bem como neurofisiologia, estudos de comportamento e evolução comportamental^{1,2,3, 4}. Drosófila olfativos tecidos casa os neurônios olfactory do receptor (ORNs) que detectam sinais químicos voláteis além de neurônios sensoriais hidro – e thermo^1,5,6. O objetivo geral do presente manuscrito é demonstrar como estágio e dissecar desenvolvimento pupal e adulto tecido olfativo em espécies de Drosophila . A justificativa para esta técnica é para gerar amostras de diferentes estágios pupal para análises moleculares e no desenvolvimento do sistema olfativo periférico, tais como RNAseq e RT-PCR quantitativo, além na vivo tecido técnicas de rotulagem . Esta técnica pode ser especialmente útil para identificar a dinâmica do transcriptional perfis no sistema olfativo em desenvolvimento adulto da espécie non –melanogaster da drosófila , que não dispõem de todos os reagentes transgênicos para o tipo de célula específico rotulagem e análises. Neste manuscrito, demonstramos como dissecar discos da antena e antenas de espécies de Drosophila pupa e adultas. Primeiro, mostramos como identificar Drosophila 0 h de formação do casulo (APF, pupas brancas ou pré-pupa) para preparo do desenvolvimento e envelhecimento espécie-específicos. Em seguida, mostramos como dissecar os discos da antena e o terceiro segmento da antena; especificamente, como dissociar o disco do olho e o segundo segmento da antena para a pureza de tecido necessária para RNAseq ou RT-PCR. Os estágios no d. melanogaster descrito neste protocolo aproximadamente correspondem ao disco da antena previamente padronizado (pré-pupa), a seleção de precursores da antena de disco (8 h APF), o início da diferenciação terminal para ORNs (40 h/a APF), e antena de adulta. Finalmente, damos exemplos para um RT-PCR quantitativo de antenas adultas isoladas usando o método e por imuno-histoquímica na vivo . Esse método pode ser usado para gerar amostras para uma análise de DNA/RNA e imuno-histoquímica no desenvolvimento de tecidos periféricos olfativos, de diferentes espécies de Drosophila .