Summary

Isolamento delle cellule stromali dell'endometrio umane per In Vitro decidualizzazione

Published: September 01, 2018
doi:

Summary

Questo studio presenta una procedura convalidata e ottimizzata per l’isolamento e la coltura delle cellule stromali dell’endometrio umane per condurre l’analisi in vitro decidualizzazione. Inoltre, questo studio fornisce un metodo dettagliato per atterramento in modo efficiente un gene specifico utilizzando siRNA in cellule stromal dell’endometrio umane.

Abstract

La differenziazione delle cellule stromale dell’endometrio umane (HESC) da fibroblasto-come l’apparenza nella decidua secretiva è una trasformazione necessaria per l’impianto dell’embrione nella mucosa uterina del grembo materno. Decidualizzazione improprio è stato stabilito come causa radice per mancato impianto e conseguente aborto spontaneo precoce l’embrione. Pertanto, comprendere i meccanismi molecolari sottostanti decidualizzazione è vantaggioso per migliorare il tasso di nascite di successo. In vivo basato su studi di decidualizzazione artificiali sono spesso limitanti a causa di dilemmi etici connessi con la ricerca umana, come pure traslazionale complicazioni all’interno di modelli animali. Di conseguenza, saggi in vitro mediante colture cellulari primarie sono spesso utilizzate per esplorare la modulazione della decidualizzazione tramite ormoni. Questo studio fornisce un protocollo dettagliato per l’isolamento di HESC e successive decidualizzazione artificiale tramite il completamento di ormoni al mezzo di coltura. Inoltre, questo studio fornisce un metodo ben progettato per atterramento qualsiasi gene di interesse utilizzando siRNA basata sui lipidi transfezioni. Questo protocollo consente l’ottimizzazione della purezza di cultura così come la resa del prodotto, in modo da massimizzare la capacità di utilizzare questo modello come un metodo affidabile per capire i meccanismi molecolari sottostanti decidualizzazione e la successiva quantificazione del agenti secreti dalle cellule stromali dell’endometrio proteina.

Introduction

Tra le tappe del menarca e la menopausa, le donne dell’età riproduttiva subiscono cicli mensili di ormone-regolata proliferazione dell’endometrio, la differenziazione e il successivo spargimento in preparazione per la gravidanza in un processo noto come mestruazioni1 ,2. Tali modifiche fisiche dell’endometrio umano sono necessari per l’impianto di embrione corretta nel parete uterina1. Alterazioni dell’endometrio, compresi gli adattamenti sia morfologici e biochimici, sono mediate durante il ciclo mestruale tramite ormoni steroidi ovarici estrogeni e progesterone (P4)3,4,5. Entro la fase proliferativa (o follicolare), estrogeno preovulatorio i livelli aumentano, avviando l’ispessimento dell’endometrio. Dopo l’ovulazione, la fase secretiva (o luteinica) promuove un aumento significativo delle concentrazioni di P4, che induce la trasformazione morfologica delle cellule stromali dell’endometrio (ESC) da fibroblasto-come l’apparenza arrotondati, epiteliale-come le cellule deciduali in un processo noto come decidualizzazione4,6. Decidualizzazione improprio è stato stabilito come causa radice per mancato impianto e successivi primi embrione aborto spontaneo4,7,8. Di conseguenza, comprendere i meccanismi molecolari sottostanti decidualizzazione è vantaggioso per la diagnosi ed il trattamento di perdita iniziale di gravidanza.

Attualmente, diverse metodologie sono utilizzati per esplorare gli effetti sottostanti di decidualizzazione su cellule stromal dell’endometrio. In vivo, l’utero del mouse può essere indotta artificialmente per decidualizzazione tramite stimolazione meccanica (cioè, graffiare) o iniezione in un utero ormonalmente innescato9di olio. Distinti dagli esseri umani, questa stimolazione sintetica promuove la differenziazione del lume uterino fornendo l’aspetto della presenza di blastocisti, un passo necessario per l’avvio di decidualizzazione in roditori10,11. Di conseguenza, a causa delle complicazioni traslazionale associate modelli animali e i dilemmi etici che circondano in vivo basato su studi in esseri umani, sono più correttamente studiati modelli decidualizzazione basato in vitro.

In questo studio, gli oggetti vengono reclutati attraverso il collocamento di pubblicità in entrambi i giornali locali inglese e spagnolo. Soggetti identificati come idonei per questo studio sono portati dentro per soddisfare con il coordinatore della ricerca, in cui una rilevazione completa dei rischi potenziali sono discussi. Al momento della conferma di una completa comprensione dei potenziali rischi, consenso degli oggetti è raggiunto in forme sia scritte che verbali. Consenso della persona interessata include autorizzazione di (1) subiscono il deposito (2) a lungo termine flebotomia dei loro tessuti per scopi di ricerca futura e (3) d’accordo per la creazione di colture primarie da esemplari raccolti del tessuto. A seguito di consenso, gli oggetti sono dati un modulo da compilare in cui consentito autoidentificazione di razza/etnia e/o il diritto di non divulgazione. Una successiva visita è prevista per raggiungere la biopsia dell’endometrio basata sul ciclo mestruale del soggetto. Volontari reclutati per questo studio riflettono entrambi la demografia etnica e razza della regione metropolitana di St. Louis, come documentato dal censimento del 2012 e non hanno coinvolto la partecipazione di qualsiasi popolazione vulnerabili, tra cui donne incinte, feti, embrioni, bambini sotto i 18 anni di età, o di altri gruppi vulnerabili. Requisiti di ammissibilità per la partecipazione alla raccolta del campione di biopsia includono (1) essere tra i 18-45 anni (2) avere cicli mestruali regolari (25-32 giorni) (3) non avendo attuale gravidanza o uso di contraccettivi ormonali/intrauterina dispositivo per 30 giorni prima dell’arruolamento (4) non avendo attuale infezione vaginale o malattie sessualmente trasmissibili (5) avendo nessuna correnti trattamenti antibiotici e (6) non avendo nessuna corrente Pap test anormale.

All’interno di questo studio, le cellule stromale dell’endometrio umane (HESC) sono coltivate e artificialmente indotte per subire in vitro decidualizzazione attraverso il completamento di ormoni (estradiolo (E2), medrossiprogesterone acetato (MPA) e adenosina ciclica monofosfato ciclico (cAMP)) al mezzo. In questo metodo, il grado di decidualizzazione è alterato basata sul numero totale di giorni di trattamento ormonale. In concomitanza con la riorganizzazione del citoscheletro, completamento ormonale induce adattamenti biochimici in cui le cellule deciduali esperienza qualità secretiva-come2,4. L’espressione dei geni di segno distintivo, come la prolattina (PRL) e proteina legante il fattore di crescita insulino-simile 1 (IGFBP1), possa essere utilizzata per confermare e quantificare il grado di HESC decidualizzazione5,12, 13 , 14. d’importanza, è dimostrata anche la vitalità di questo protocollo per condurre atterramento specifico gene.

Protocol

Tutte le biopsie dell’endometrio umano raccolte per questo studio sono state conseguite presso l’Università di Washington a St. Louis, dipartimento di ostetricia e ginecologia utilizzando un Institutional Review Board (IRB) ha approvato il modulo di consenso scritto. 1. preparazione Preparare 500 mL di 1 x di Hank bilanciato sale soluzione (HBSS) aggiungendo 100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina nel flacone contenente media (ulteriore riferito come HBSS + medio).</l…

Representative Results

Decidualizzazione HESC cultura A seguito di isolamento, cellule stromali dell’endometrio umane sono state coltivate ad una formazione di monostrato con confluency di 80-90% e indotta per in vitro decidualizzazione trattando con 10 nM E2, 1 µM MPA e 50 µM cAMP (EPC). Cambiamenti morfologici associati in vitro decidualizzazione sono stati visualizzati in Figura 1A….

Discussion

Il ciclo mestruale femminile riproduttivo è caratterizzato da un aumento nei livelli di progesterone durante la fase luteale, quindi inducendo la decidualizzazione dell’ESC in tondo, epiteliale-come le cellule secretive3,8. L’iniziazione di decidualizzazione è specie dipendenti. In esseri umani, decidualizzazione si verifica spontaneamente al momento l’aumento della concentrazione del progesterone, mentre topi richiedono blastocisti presenza10…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Materials

Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium Gibco 31985-070 For decidualization media
DMEM / F12 (1:1) (1X) Gibco 11330-032
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061 For cell count
PureLink RNA Mini Kit Invitrogen 12183018A For RNA Isolation/Purification
TaqMan 2X Universal PCR Master Mix Applied Biosystems 4304437
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems 4374967
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control Life Technologies 4319413E For qPCR internal control
TaqMan Gene Expression Assay Prolactin Probe Applied Biosystems 4331182 For qPCR internal control
TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 Probe Applied Biosystems 4331182 For qPCR internal control
Phalloidin-iFluor 488 Reagent – CytoPainter Abcam ab176753
Human Prolactin ELISA Kit Invitrogen EHIAPRL
16% Paraformaldehyde Alfa Aesar 30525-89-4 Fixative
Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen 13778150 Transfection Reagent
ProLong Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P36935 For mounting
0.25% Trypsin-EDTA (1X) Gibco 25200-056
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122
Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum Sigma F6765-500ML
Sodium Bicarbonate (7.5%) Gibco 25080-094
Ficoll-Paque PLUS Reagent Fisher Scientific 45001749
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma C0130-1G
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma DN25-100MG
Medroxyprogesterone 17-acetate Sigma M1629-1G For EPC Media
Estradiol Sigma E1024-1G For EPC Media
cAMP Sigma A6885-100MG For EPC Media
Fine straight stitch scissors Fine Science Tools 15396-00
TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe Applied Biosystems 4351372
Fetal Bovine Serum, heat inactivated Gibco 10-082-147
Antibiotic-antimycotic Thermo Scientific 15240062
Hank’s Balanced Salt Solution  Corning 21-021-cv
50 mL conical polypropylene Falcon tube Corning 352098
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35
100 x 15 mm Glass Petri dish VWR 75845-546
40 micron cell strainer Midsci 229481
Isotemp 215 Water bath Fisher Scientific FS-215
LSE Centrifuge  Corning 6755
Human NCOA2 siRNA  Dharmacon L-020159-00 Gene specific qPCR probe
Steri-cycle i160 CO2 Incubator  Thermo Scientific 51030301
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000 For RNA quantification
Phosphate Buffered Saline  Fisher Scientific 50146771
75 cm Canted Neck Cell Culture flask Corning 430641U
6 well Non-Pyrogenic Cell Culture Plate Corning 3506
Pipet Controller Ultra Corning 4099
Photoshop Adobe 19.0.1.334
25 cm Canted Neck Cell Culture flask Corning 7200876
Triton X-100 Sigma X100-1L
15 mL conical polypropylene Falcon tube Corning 352099
10 mL Syringe BD 302995
1300 Series A2 Biological Safety Hood Thermo Scientific 1377
accuspin Micro17 centrifuge Fisher Scientific 13100675
7500 Fast real time PCR system Applied Biosystems 3052632
EVOS FL Immunofluorescence Microscope Life Technologies 01414-155G-291
Leica Inverted Light Microscope Leica DMi1
Illrustrator Adobe 22.0.1.253
Excel Spreadsheets Microsoft 2016
Deckglaser 18 mm cover glasses NeuVitro GG-18
Reichert Bright-Line Hemacytometer Sigma Z359629-1EA
2-mercaptoethanol Fisher Bioreagents BP176-100 For RNA lysis buffer
1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial Corning 430658 For freezing HESC cells 
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma D2650-100mL For freezing media

References

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Cite This Article
Michalski, S. A., Chadchan, S. B., Jungheim, E. S., Kommagani, R. Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization. J. Vis. Exp. (139), e57684, doi:10.3791/57684 (2018).

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