Isolamento de células do estroma Endometrial humanas para In Vitro Decidualization

Entre os estágios da menarca e menopausa, as mulheres em idade reprodutiva sofrem ciclos mensais de proliferação endometrial hormônio-regulada, diferenciação e subsequente derramamento em preparação para a gravidez em um processo conhecido como menstruação^{1 ,2}. Tais modificações físicas do endométrio humano são necessárias para a implantação do embrião adequado para a parede uterina¹. Alterações do endométrio, incluindo adaptações morfológicas e bioquímicas, são mediadas por todo o ciclo menstrual através de hormônios esteroides ovarianos estrógeno e progesterona (P4)^3,4,5. No âmbito da fase proliferativa (ou folicular), os níveis de estrogênio preovulatory aumento, iniciando o espessamento do endométrio. Após a ovulação, a fase secretora (ou lútea) promove um aumento significativo nas concentrações de P4, induzindo a transformação morfológica das células do estroma endometriais (ESC) da aparência de fibroblasto arredondados, células epiteliais-decidual em um processo conhecido como decidualization^4,6. Decidualization impróprio foi estabelecida como das causas para o fracasso do implante e posterior início embrião aborto espontâneo de^4,de^7,8. Portanto, compreender os mecanismos moleculares subjacentes decidualization é vantajoso para o diagnóstico e o tratamento de perda de gravidez precoce.

Atualmente, várias metodologias são utilizadas para explorar os efeitos subjacentes de decidualization em células do estroma endometriais. In vivo, o útero de rato pode ser induzida artificialmente para decidualization através de estimulação mecânica (i.e.,coçar) ou injeção em um útero hormonalmente condicionadas⁹de óleo. Distintos dos humanos, esta estimulação sintética promove a diferenciação do lúmen uterino, fornecendo a aparência da presença de blastocisto, um passo que é necessário para a iniciação de decidualization em roedores^10,11. Nesse sentido, devido as complicações translacionais associadas com modelos animais e os dilemas éticos que cercam na vivo com base em estudos em seres humanos, modelos de decidualization com base são estudados com mais êxito in vitro.

Neste estudo, os sujeitos são recrutados através da colocação de anúncios em dois jornais locais, inglês e espanhol. Indivíduos identificados como candidatos adequados para este estudo são trazidos para se reunir com o coordenador da pesquisa, em que uma divulgação completa dos riscos potenciais são discutidos. Após a confirmação de uma compreensão completa dos riscos potenciais envolvidos, consentimento dos sujeitos é atingido nas formas verbais e escritas. Consentimento do sujeito inclui permissão para (1) submetido a armazenagem (2) a longo prazo de flebotomia de seus tecidos para fins de pesquisa futura e (3) concordar com a criação de culturas primárias de amostras de tecido coletadas. Após consentimento, indivíduos recebem um formulário para preencher no qual auto-identificação permitida de raça/etnia e/ou o direito de não-divulgação. Uma visita subsequente é programada para atingir a biópsia de endométrio com base no ciclo menstrual do sujeito. Voluntários recrutados para este estudo, refletem a demografia étnica e racial da região metropolitana de St. Louis, como documentado pelo censo de 2012 e que não envolvem a participação de qualquer população vulnerável, incluindo mulheres grávidas, fetos, embriões, crianças menores de 18 anos de idade, ou de outros grupos vulneráveis. Requisitos de elegibilidade para participação na coleção de amostra de biópsia incluem (1) estar entre as idades de 18-45 anos (2) ter ciclos menstruais regulares (25-32 dias) (3) não ter nenhuma gravidez atual ou uso de dispositivo intra-uterino hormonal/contraceptivos por 30 dias antes da inscrição (4) sem qualquer infecção vaginal atual ou doenças sexualmente transmissíveis (5) tendo nenhum atuais tratamentos com antibióticos e (6) não tendo nenhum atual de Papanicolau anormais.

Dentro deste estudo, células do estroma endometriais humanas (HESC) são cultivadas e induzidas artificialmente a submeter-se decidualization em vitro através da suplementação de hormônios (estradiol (E2), acetato de medroxiprogesterona (MPA) e adenosina cíclica monofosfato (cAMP)) ao meio. Neste método, o grau de decidualization é alterado com base no número total de dias de tratamento hormonal. Em conjunto com o rearranjo do citoesqueleto, suplementação hormonal induz adaptações bioquímicas em que as células decidual experimentam de qualidades secretoras^2,4. A expressão de genes de marca, tais como a prolactina (PRL) e proteína fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGFBP1), pode ser utilizada para confirmar e quantificar o grau de HESC decidualization^{5,12, 13 , 14}. importante, a viabilidade do presente protocolo realizar knockdown específicos do gene também é demonstrada.