Summary

Aislamiento de células Stromal Endometrial humanas In Vitro Decidualization

Published: September 01, 2018
doi:

Summary

Este estudio presenta un procedimiento optimizado y validado para el aislamiento y cultivo de células stromal endometriales humanas para llevar a cabo análisis de decidualization en vitro . Además, este estudio proporciona un método detallado para eficiente precipitación un gen específico usando siRNA en células stromal endometriales humanas.

Abstract

La diferenciación de células stromal endometriales humanas (HESC) de fibroblasto-como aspecto en decidua secretor es una transformación necesaria para la implantación del embrión en el revestimiento del útero de la matriz materna. Decidualization incorrecta se ha establecido como una causa de fallo de implantación y posterior aborto espontáneo del embrión temprano. Por lo tanto, entender los mecanismos moleculares subyacentes decidualization es ventajoso mejorar el índice de nacimientos exitosos. En vivo basado en estudios de decidualization artificial a menudo se limitan debido a dilemas éticos asociados a la investigación en humanos, así como complicaciones traslacionales en modelos animales. Como resultado, en vitro ensayos a través de cultivo celular primario son utilizados a menudo para explorar la modulación del decidualization a través de las hormonas. Este estudio proporciona un protocolo detallado para el aislamiento de células y posterior decidualization artificial mediante la suplementación de hormonas al medio de cultivo. Además, este estudio proporciona un método bien diseñado para caída cualquier gen de interés utilizando siRNA basado en lípidos transfecciones. Este protocolo permite la optimización de la pureza de la cultura, así como rendimiento del producto, maximizando así la capacidad para utilizar este modelo como un método confiable para entender los mecanismos moleculares subyacentes decidualization y la posterior cuantificación de agentes secretados por las células estromales del endometrio decidualized.

Introduction

Entre las etapas de la menarquia y la menopausia, las mujeres en edad reproductiva se someten a ciclos mensuales de la proliferación endometrial regulados por hormonas, la diferenciación y el posterior vertimiento en preparación para el embarazo en un proceso conocido como menstruación1 ,2. Las modificaciones físicas del endometrio humano son necesarias para la implantación adecuada del embrión en la pared uterina1. Alteraciones del endometrio, incluyendo adaptaciones tanto morfológicas como bioquímicas, son mediadas a través del ciclo menstrual a través de las hormonas esteroides ováricas estrógenos y progesterona (P4)3,4,5. Dentro de la fase proliferativa (o folicular), los niveles de estrógenos preovulatorio aumento, Inicio de engrosamiento del endometrio. Después de la ovulación, la fase secretora (o luteínica) promueve un aumento significativo en las concentraciones de P4, induciendo la transformación morfológica de células stromal endometriales (ESC) de aspecto fibroblasto-como redondeadas, epitelial-como las células decidual en un proceso conocido como decidualization4,6. Decidualization incorrecta se ha establecido como una causa de fracaso de implantación y posterior temprano embrión aborto4,7,8. Por lo tanto, entender los mecanismos moleculares subyacentes decidualization es ventajoso para el diagnóstico y tratamiento de la pérdida temprana del embarazo.

Actualmente, se utilizan varias metodologías para explorar los efectos subyacentes del decidualization en células stromal endometriales. In vivo, el útero de ratón puede ser inducida artificialmente para decidualization mediante estimulación mecánica (es decir, arañazos) o aceite de inyección en un útero preparado hormonal9. Distinto de los seres humanos, esta estimulación sintética promueve la diferenciación del lumen uterino proporcionando la apariencia de la presencia de blastocistos, un paso que se requiere para la iniciación del decidualization en roedores10,11. En consecuencia, debido a las complicaciones traslacionales asociadas con modelos animales y los dilemas éticos que rodean en vivo basado en estudios en seres humanos, con más éxito se estudian modelos decidualization basado en vitro.

En este estudio, los sujetos son reclutados a través de la colocación de anuncios en dos periódicos locales de inglés y español. Temas identificados como candidatos adecuados para este estudio se traen adentro para reunirse con el Coordinador de la investigación, en el que se discuten una divulgación completa de los riesgos potenciales. Sobre la confirmación de una comprensión completa de los riesgos potenciales involucrados, consentimiento de los sujetos se logró en forma escrita y verbal. Consentimiento del sujeto incluye permiso (1) almacenamiento (2) a largo plazo de flebotomía de sus tejidos para la investigación futura y (3) de acuerdo a la creación de cultivos primarios de muestras de tejido recogidas. Después de consentimiento, temas reciben un formulario para completar en que líos permitidos de raza/origen étnico y el derecho de confidencialidad. Una visita subsecuente está programada para obtener la biopsia de endometrio basada en el ciclo menstrual del sujeto. Voluntarios reclutados en este estudio reflejan la demografía étnica y racial de la región metropolitana de St. Louis como se documenta en el censo 2012 y no implicó la participación de todas las poblaciones vulnerables incluyendo mujeres embarazadas, fetos, embriones, niños menores de 18 años de edad, o de otros grupos vulnerables. Requisitos de elegibilidad para la participación en la toma de muestras de biopsia incluyen (1) ser entre las edades de 18-45 años (2) tener ciclos menstruales regulares (días 25-32) (3) no tener ningún embarazo actual o uso de dispositivo intrauterino/hormonales anticonceptivos 30 días antes de la inscripción (4) no actual infección vaginal o enfermedades de transmisión sexual (5) que no los tratamientos antibióticos actuales y (6) no que actual citología vaginal anormal.

Dentro de este estudio, las células stromal endometriales humanas (HESCS) son cultivadas y artificialmente inducidas a decidualization en vitro a través de la suplementación de hormonas (estradiol (E2), acetato de medroxiprogesterona (MPA) y adenosina cíclica monofosfato (cAMP)) al medio. En este método, el grado de decidualization se altera en base en el número total de días de tratamiento hormonal. Junto con el cambio de citoesqueleto, suplementación hormonal induce adaptaciones bioquímicas en el cual las células decidual experimentan cualidades secretores como2,4. La expresión de genes de la seña de identidad, como la prolactina (PRL) y la proteína de unión a factor de crecimiento insulínico tipo 1 (IGFBP1), puede ser utilizada para confirmar y cuantificar el grado de HESCS decidualization5,12, 13 , 14. lo importante, también se demuestra la viabilidad de este protocolo para llevar a cabo la caída específica del gene.

Protocol

Todas las biopsias de endometrio humano recogidas para este estudio fueron logradas por la Universidad de Washington en St. Louis, Departamento de Obstetricia y Ginecología mediante una Junta de revisión institucional (IRB) había aprobado el formulario de consentimiento escrito. 1. preparación Preparar 500 mL de 1 x de Hank equilibrada solución de sal (HBSS) mediante la adición de 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL estreptomicina a la botella que contiene los medios de comunic…

Representative Results

Decidualization en cultivo de células Tras aislamiento, las células stromal endometriales humanas fueron cultivadas a una formación de monocapa con 80-90% de confluencia e inducida por decidualization en vitro por tratar con 10 nM E2, 1 μm MPA y campamento de 50 μm (EPC). Cambios morfológicos asociados con en vitro decidualization fueron visualizados en la figura 1A</…

Discussion

El ciclo menstrual reproductivo femenino se caracteriza por un aumento en los niveles de progesterona durante la fase lútea, de tal modo induciendo el decidualization del ESC en Ronda, epiteliales como células secretoras3,8. La iniciación del decidualization es especie dependiente. En los seres humanos, decidualization se produce espontáneamente tras el aumento de la concentración de progesterona, mientras que ratones requieren presencia de blastocistos<sup …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores no tienen nada que revelar.

Materials

Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium Gibco 31985-070 For decidualization media
DMEM / F12 (1:1) (1X) Gibco 11330-032
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061 For cell count
PureLink RNA Mini Kit Invitrogen 12183018A For RNA Isolation/Purification
TaqMan 2X Universal PCR Master Mix Applied Biosystems 4304437
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems 4374967
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control Life Technologies 4319413E For qPCR internal control
TaqMan Gene Expression Assay Prolactin Probe Applied Biosystems 4331182 For qPCR internal control
TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 Probe Applied Biosystems 4331182 For qPCR internal control
Phalloidin-iFluor 488 Reagent – CytoPainter Abcam ab176753
Human Prolactin ELISA Kit Invitrogen EHIAPRL
16% Paraformaldehyde Alfa Aesar 30525-89-4 Fixative
Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen 13778150 Transfection Reagent
ProLong Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P36935 For mounting
0.25% Trypsin-EDTA (1X) Gibco 25200-056
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122
Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum Sigma F6765-500ML
Sodium Bicarbonate (7.5%) Gibco 25080-094
Ficoll-Paque PLUS Reagent Fisher Scientific 45001749
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma C0130-1G
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma DN25-100MG
Medroxyprogesterone 17-acetate Sigma M1629-1G For EPC Media
Estradiol Sigma E1024-1G For EPC Media
cAMP Sigma A6885-100MG For EPC Media
Fine straight stitch scissors Fine Science Tools 15396-00
TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe Applied Biosystems 4351372
Fetal Bovine Serum, heat inactivated Gibco 10-082-147
Antibiotic-antimycotic Thermo Scientific 15240062
Hank’s Balanced Salt Solution  Corning 21-021-cv
50 mL conical polypropylene Falcon tube Corning 352098
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35
100 x 15 mm Glass Petri dish VWR 75845-546
40 micron cell strainer Midsci 229481
Isotemp 215 Water bath Fisher Scientific FS-215
LSE Centrifuge  Corning 6755
Human NCOA2 siRNA  Dharmacon L-020159-00 Gene specific qPCR probe
Steri-cycle i160 CO2 Incubator  Thermo Scientific 51030301
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000 For RNA quantification
Phosphate Buffered Saline  Fisher Scientific 50146771
75 cm Canted Neck Cell Culture flask Corning 430641U
6 well Non-Pyrogenic Cell Culture Plate Corning 3506
Pipet Controller Ultra Corning 4099
Photoshop Adobe 19.0.1.334
25 cm Canted Neck Cell Culture flask Corning 7200876
Triton X-100 Sigma X100-1L
15 mL conical polypropylene Falcon tube Corning 352099
10 mL Syringe BD 302995
1300 Series A2 Biological Safety Hood Thermo Scientific 1377
accuspin Micro17 centrifuge Fisher Scientific 13100675
7500 Fast real time PCR system Applied Biosystems 3052632
EVOS FL Immunofluorescence Microscope Life Technologies 01414-155G-291
Leica Inverted Light Microscope Leica DMi1
Illrustrator Adobe 22.0.1.253
Excel Spreadsheets Microsoft 2016
Deckglaser 18 mm cover glasses NeuVitro GG-18
Reichert Bright-Line Hemacytometer Sigma Z359629-1EA
2-mercaptoethanol Fisher Bioreagents BP176-100 For RNA lysis buffer
1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial Corning 430658 For freezing HESC cells 
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma D2650-100mL For freezing media

References

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Cite This Article
Michalski, S. A., Chadchan, S. B., Jungheim, E. S., Kommagani, R. Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization. J. Vis. Exp. (139), e57684, doi:10.3791/57684 (2018).

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