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Biology

Mündliche bakterielle Infektion und Shedding in Drosophila melanogaster

Published: May 31, 2018
doi:
10.3791/57676
, , , ,
1Institute of Evolutionary Biology, School of Biological Sciences,University of Edinburgh, 2IGDR – CNRS UMR 6290, 3Centre for Immunity, Infection and Evolution,University of Edinburgh

Summary

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Oral verfügbar zu machen und die Fruchtfliege Drosophila MelanogasteR mit bakteriellen Krankheitserregern zu infizieren und die Anzahl der infektiöse Bakterien Schuppen nach Darm-Infektion zu messen. Wir beschreiben weiter die Wirkung des Immunsystems Mutanten auf Fliege Überleben nach oraler bakterieller Infektion.

Abstract

Die Fruchtfliege Drosophila Melanogaster ist eines der am besten entwickelten Modellsysteme der Infektion und angeborene Immunität. Während die meisten Arbeiten auf systemische Infektionen konzentriert hat, gab es ein Anstieg des Interesses an den Mechanismen der Darm Immunkompetenz gegenüber Krankheitserregern, erfordern Methoden, mündlich fliegen zu infizieren. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um individuelle fliegt eine opportunistische bakterielle Erreger (Pseudomonas Aeruginosa) und eine natürliche bakterielle Erreger von D. Melanogaster (Pseudomonas Entomophila) Oral verfügbar zu machen. Das Ziel dieses Protokolls ist, ein robustes Verfahren um männliche und weibliche fliegt diese Erreger verfügbar zu machen. Wir bieten repräsentative Ergebnisse zeigen überleben Phänotypen, Mikrobe Lasten und bakterielle vergießen, was relevant für das Studium der Heterogenität bei der Übertragung der Erreger. Schließlich bestätigen wir, dass Dcy Mutanten (fehlt die schützende Peritrophic Matrix in den Darm Epithel) und genießen Sie Mutanten (fehlt einen funktionale Immunschwäche (IMD) Weg), erhöhten Anfälligkeit für bakterielle orale Infektion zu zeigen. Dieses Protokoll beschreibt daher eine robuste Methode zu infizieren fliegen mit dem oralen Weg der Infektion, die für die Untersuchung von einer Vielzahl genetischer und umweltbedingter Quellen Variation in Darm-Infektion Ergebnisse und bakterielle Übertragung erweitert werden kann.

Introduction

Die Fruchtfliege (auch bekannt als die Essig-Fliege), D. Melanogaster, wurde ausgiebig als Modellorganismus für die Infektion und Immunität gegen eine Vielzahl von Krankheitserregern1,2eingesetzt. Dieses Werk bietet grundlegende Einsichten in die physiologischen Folgen einer Infektion und wurde auch Pionierarbeit in der Entschlüsselung der molekularen Wege zugrunde liegt die Host Immunantwort gegen Parasitoiden, Bakterien, Pilzen und virale Infektionen. Dieses Wissen ist nicht nur nützlich, um die angeborene Immunantwort von Insekten und andere Wirbellose zu verstehen, sondern weil viele der Abwehrmechanismen zwischen Insekten und Säugetieren evolutionär konserviert sind, Drosophila ist zugleich der Auslöser für der Entdeckung der wichtigsten Abwehrmechanismen bei Säugetieren, einschließlich Menschen3.

Die meisten Arbeiten an Drosophila Infektion und Immunität konzentrierte sich auf systemische Infektionen mit Impfung-Methoden, die Erreger direkt in den Körper des Insekts durch stechen oder Injektion4,5,6liefern. Der Vorteil dieser Methoden darin, dass die Lieferung einer kontrollierten infektiöse Dosis ist klar und unterstützt durch einen großen Körper der Arbeit an systemischen Infektionen. Allerdings sind viele natürlich vorkommende bakterielle Erreger von D. Melanogaster erworben durch Fütterung auf Zersetzung organischen Substanz wo Darm Immunkompetenz eine bedeutende Rolle im Host Verteidigung7,8, spielt 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. Experimente, die systemische Infektionen beschäftigen diese Schutzmechanismen zu umgehen, und daher stellen ein ganz anderes Bild von wie Insekten Abwehr gegen natürliche Krankheitserreger montieren. Dies ist besonders relevant, wenn das Ziel der Arbeit ist, Vorhersagen über die Ökologie und Evolution der Infektion zu testen wo ist die Verwendung von natürlichen Krankheitserreger und Infektionswege wichtig16,17. Neuere Arbeiten hat deutlich gemacht, wie die Route der Erreger deutlich beeinflusst Krankheit Ergebnis18,19, entlockt unterschiedliche immun Wege20,21, bestimmen die schützende Wirkung von Endosymbionts16geerbt, und kann sogar spielen eine wichtige Rolle in der Entwicklung der Host Verteidigung17.

Ein weiterer Grund, mündliche Wege der Infektion zu beschäftigen ist, dass die Untersuchung der Variation bei der Übertragung der Erreger durch Messung der bakteriellen Abbau während der fäkalen Ausscheidung nach oraler Infektion22,23, können 24. Verständnis der Quellen der Host Heterogenität in der Übertragung von Krankheiten ist in natürlichen Populationen25,26herausfordernd, aber Komponenten des Getriebes, wie Erreger vergießen unter kontrollierten Laborbedingungen Messen Bedingungen bietet eine sinnvolle alternative Vorgehensweise27. Durch Fütterung fliegen Bakterien und Mess bakteriellen Abbau unter einer Vielzahl von genetischen und umweltbedingten Kontexten in kontrollierten experimentellen Bedingungen ist es möglich, Abweichungen bei der Übertragung unter Hosts zu identifizieren.

Hier beschreiben wir ein Protokoll für mündlich D. Melanogaster mit bakteriellen Krankheitserregern zu infizieren, und für die Quantifizierung der Bakterienwachstum und vergießen, folgt (Abbildung 1). Wir beschreiben dieses Protokoll auf zwei Pseudomonas -Bakterien: einem virulenten Stamm von opportunistischen Erreger p. Aeruginosa (PA14) und ein weniger virulenten Stamm der natürlichen Erreger p. Entomophilafliegen. Pseudomonaden sind gemeinsame Gram-negativen Bakterien mit ein breites Wirtsspektrum, infizieren, Nematoden, Insekten, Pflanzen und Wirbeltiere, und finden sich in den meisten Umgebungen4,6. Enterische Infektion von Drosophila durch p. Aeruginosa und p. Entomophila führt in der Pathologie bis Darm Epithelien12,13,14,15, 28. Während wir uns auf diese zwei bakterielle Erreger konzentrieren, können die hier beschriebenen Methoden im Prinzip auf jede bakterielle Erreger von Interesse mit geringfügigen Änderungen angewendet werden. Nach oraler Exposition wir nach der Infektion überleben, und messen die Mikrobe Last innerhalb einzelner fliegen und lebensfähigen Mikroben Schuppen in der Umwelt, ausgedrückt in koloniebildenden Einheiten (KBE). Endlich, denn Darm Immunkompetenz ergibt sich aus einer Kombination der epitheliale Barriere und humorale Reaktionen, messen wir auch das Überleben der Fliegenschnüre, wo diese Schutzmaßnahmen gestört werden. Insbesondere Drosocrystallin (Dcy) Mutanten haben bereits gezeigt, dass anfälliger für mündliche bakterielle Infektion aufgrund einer erschöpften Peritrophic Matrix in der Darm-29. Wir messen auch überleben in ein Relish (Rel)-Mutante, die von der Produktion von antimikrobieller Peptiden gegen Gram-negativen Bakterien über die IMD Weg30behindert wird.

Protocol

1. pflegen Sie fliegen Fliegen in 23 mL Kunststoff Ampullen mit 7 mL frisch zubereiteten Lewis Medium zu erhalten (geändert von Referenz-31; 1 L dreifach destilliert, H2O, 6,1 g Agar, 93,6 g Braunzucker, 68 g Mais, 18,7 g instant-Hefe, 15 mL Tegosept Anti-Pilz-Mittel) in Inkubatoren bei 25 ± 1 ° C in 12 H:12 h hell: Dunkel-Zyklus mit ~ 60 % Luftfeuchtigkeit. Stecken Sie die Fläschchen mit nichtsaugenden Watte. Alle 14 Tage transfer 20 – 30 Erwachsene zu einem neuen Lebensmittel-Fläschchen mit instant, trockene Hefe hinzugefügt, um die Oberfläche für 2 – 3 Tage zur Eiablage um auftreten zu ermöglichen. Sicherzustellen Sie nach dieser Zeit, dass die Eier auf die Oberfläche der Lebensmittel sichtbar sind. Entfernen Sie die Erwachsene fliegen.Hinweis: Das hält fliegen in die Fläschchen als einzigen Generation, Alter abgestimmt Populationen. Lassen Sie die Eier zu entwickeln.Hinweis: Bei 25 ° C, Erwachsene fliegen Puppen an Tag 11 zu Eclose ab und fahren Sie über 12 – 14 Tage. 2. bereiten Sie experimentelle fliegen Sammeln Sie die Eier der Elterngeneration in einem Bevölkerung/Embryo-Kollektion-Käfig auf einer 75 mL Apfel-Agar-Platte (1 L dreifach destilliertem H2O, 30 g Agar, 33 g Saccharose, 330 mL Apfelsaft, 7 mL Tegosept Anti-Pilz-Mittel) mit einem Hefe-Paste-Spread (Mischung Trockenhefe mit Erdnussbutter-ähnliche Konsistenz Wasser). Fügen Sie Wasser getränkten Wattebausch in den Käfig, Feuchtigkeit bieten.Hinweis: Um zu vermeiden, verwirrende Effekte durch Larven Aufzucht Dichteunterschiede, ist es wichtig, dass experimentelle fliegen in verschiedenen Fläschchen in ähnliche dichten aufgezogen werden. Die oben genannten Schritt wird durchgeführt, um zu vermeiden, verwirrende Effekte. 24 h bei 25 ° C in einer 12 H:12 h inkubieren hell: Dunkel-Zyklus bis Eiablage stattgefunden hat. Wenn nach 24 Stunden gibt es zu wenige Eier, bieten Sie eine längere Gewöhnung. Ersetzen Sie Apple-Agarplatten und warten Sie Eiablage um für weitere 24 h auftreten. Ei-beladenen Apfel-Agarplatten aus dem Käfig der Bevölkerung zu nehmen. Entfernen Sie die restliche Hefe-Paste und keine Toten fliegen aus der Agar-Oberfläche. Tauchen Sie das Agar in 20 mL 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und vertreiben Sie die Eier aus dem Apple-Agar mit einem feinen Pinsel sanft zu. Während in PBS angehalten, übertragen Sie die Eier auf eine 50 mL Zentrifugenröhrchen und für 5 min lassen Sie, damit die Eier zu Boden sinken.Hinweis: Die meisten Eier befinden sich am äußeren Rand des Nährbodens. Nehmen Sie durch Abschneiden der unteren 4 mm eine gefilterte PIPETTENSPITZE p1000 und die PIPETTENSPITZE 1 mL der Lösung, genommen vom unteren Ende der 50 mL Zentrifugenröhrchen zu zeichnen. Auf einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch übertragen Sie und ermöglichen Sie es, sich niederzulassen.Hinweis: Wenn Sie Eier pipettieren, ist Snap-Freigabe der Kolben effizienter als eine sanfte Version. Entfernen Sie durch Abschneiden der unteren 4 mm eine gefilterte PIPETTENSPITZE p20. Legen Sie die Pipette auf eine gewünschte Lautstärke und vom unteren Rand der Microcentrifuge Schlauch ziehen.Hinweis: Mit der Praxis, ein Volumen von 5 µL enthält etwa 100 Eier. Verzichten Sie die gesammelten Eier auf das Essen und lassen sie für die erforderliche Menge an Zeit zu entwickeln. 3. bakterielle Kultur P. Entomophila und p. Aeruginosa Kulturen wachsen, impfen 10 mL Luria-Bertani (LB) Brühe mit 100 µL einer gefrorenen bakterielle Aktie bei 30 ° C (p. Entomophila) und 37 ° C (p. Aeruginosa), beziehungsweise. Schütteln Sie bei 150 u/min über Nacht. Sicherstellen Sie, dass die Bakterienkultur die Sättigung Phase erreicht. Um sicherzustellen, dass die Bakterien zur impfen der Flies in der exponentiellen Phase und schnell replizieren, die über Nacht Kultur in eine neue Subkultur, der eine gewünschte Lautstärke am nächsten Morgen impfen. Sicherstellen Sie, dass die Pre-Inokulum 10 % des Gesamtvolumens der Subkultur-Kultur.Hinweis: Oraler Infektion erfordert hohe. Es ist daher notwendig, ein beträchtliches Volumen der bakteriellen Kultur wachsen, so dass genügend Inokulation Kultur für die gewünschte Dosis und experimentelle Größe hergestellt werden kann. Berechnen, wieviel Subkultur benötigt wird, um die erforderliche infektiöse Dosen unter Verwendung der Gleichung MsVs = MichVich, wo M steht für eine Kultur der Extinktion gemessen bei 600 nm (OD600) Wert und V stellt seine Volumen. Tiefgestellte Buchstaben beziehen sich auf ob die Kultur als eine Subkultur (s) oder eine infektiöse Dosis (i) verwendet wird. Wachsen Sie diese Subkultur in einem 2 L konischen Kolben in einem Volumen, sodass der Subkultur Oberfläche (höchstens) nur über den Anfang der Küvette Hang fällt. Füllen Sie Sie nicht oberhalb dieser Marke, da es das Wachstum von Bakterien hemmen wird. Sicherzustellen Sie, dass die Bakterien in dieser Subkultur in der exponentiellen Wachstumsphase durch die Messung der OD alle 30 Minuten.Hinweis: Dies tritt nach 3 – 5 h, wo die Subkultur eine OD600 zwischen 0,6-0,8 erreicht. Gießen Sie gleiche Volumina dieser Subkultur über 50 mL Zentrifuge Röhren und Drehen der Subkultur bei 2.500 x g für 15 min bei 4 ° C, um die Bakterien zu Pellets. Sobald oelletiert, entfernen Sie und dann drehen Sie die überstand wieder auf die oben genannten Bedingungen für das Entfernen der großen Mehrheit der Bakterien zu bestätigen.Hinweis: Ein Pellet zu vernachlässigende Größe (kleiner als 1 mm in der Höhe) bestätigt dies. Kombinieren Sie die bakterielle Pellets der separaten Röhren durch aussetzen sie erneut in 5 mL Subkultur überstand und Rekombination dieser Lösungen in einem einzigen 50 mL-Tube. Drehen Sie diese konzentrierte Kultur bei 2.500 x g für 15 min bei 4 ° C, um die Bakterien zu Pellets. Entfernen Sie den überstand zu und wieder auszusetzen Sie das endgültige Bakterien Pellet in 5 % Saccharose-Wasser-Lösung. Die OD prüfen und Einstellen der gewünschten infektiöse Dosis (OD600 = 100 für p. Entomophila8 und OD600 = 25 für p. Aeruginosa16,28), durch erneute Aussetzung die Pellets in 5 % Saccharose-Wasser-Lösung um die gewünschte Lautstärke.Hinweis: Die Höhe von 5 % Saccharose-Wasser-Lösung hinzugefügt werden kann berechnet werden mit der Gleichung in Schritt 3.2.1 (MsVs = MichVich). (4) Oral infizieren fliegen Um die oralen Infektion zu gewährleisten, verhungern Sie die fliegen für 2 – 4 h vor der Exposition gegenüber Bakterien durch die fliegen auf standard Agar Fläschchen (1 L dreifach destilliert H2O, 20 g Agar, 84 g Braunzucker, 7 mL Tegosept Anti-Pilz-Mittel) zu übertragen. Bereiten Sie Infektion Fläschchen, während fliegen verhungert sein. Machen ein Pseudomonas -Infektion-Fläschchen durch pipettieren 500 µL standard Zucker Agar in den Deckel ein 7 mL Probenröhrchen und trocknen lassen. Legen Sie eine Disc Filterpapier im Deckel und 100 µL der bakteriellen Kultur direkt auf die Filterscheibe pipette. Ersetzen Sie für Kontrolle Infektionen die Bakterienkultur mit dem gleichen Volumen von 5 % Saccharose-Wasser-Lösung auf dem Filterpapier. Das Probenröhrchen einzelne fliegen hinzu und lassen Sie für 18 – 24 h. Oralen Infektion bestätigen, zuerst Oberfläche-sterilisieren die fliegen sofort nach der bakteriellen Belastung, indem man sie in 100 µL 70 % Ethanol für 20-30 s. entfernen das Ethanol und hinzufügen 100 µL dreifach destilliertes Wasser für 20-30 s vor das Wasser zu entfernen. Fügen Sie 100 µL 1 X PBS und homogenisieren Sie die Fliege zu. Das Homogenat auf der obersten Zeile einer 96-Well-Platte übertragen und alle weit unter 90 µL 1 X PBS hinzufügen. Verdünnen Sie seriell in diesem Beispiel um eine Reihe von KBE-Werte zu unterscheiden. Nehmen Sie 10 µL der Homogenat im oberen Brunnen und fügen Sie diese zu dem Brunnen unterhalb. Wiederholen Sie diesen Schritt mit dem zweiten gut, gut, 10 µL auf der Dritten übertragen und so weiter, für möglichst viele serielle Verdünnungen als erforderlich.Hinweis: Es ist wichtig, dass neue Pipettenspitzen für jeden Satz von Verdünnungen verwendet werden. Platte die serielle Verdünnungen auf einer LB Nähragar Platte in 5 µL Tröpfchen, um sicherzustellen, dass alle Tröpfchen diskret bleiben. Brüten Sie die LB-Agar-Platten über Nacht bei 30 ° C und 37 ° C für p. Entomophila und p. Aeruginosa, bzw. und zählen Sie sichtbar KBE.Hinweis: Während Drosophila Darm Mikroben verschiedene anaerobe Bedingungen erfordern, kann selektiven Medium, z. B. Pseudomonas isoliert Medium (PIM), verwendet werden, um sicherzustellen, dass nur Pseudomonas KBE gezählt werden. Berechnen Sie die Anzahl der KBE pro Fliege durch zählen der Anzahl der Kolonien an die serielle Verdünnung wo 10 – 60 KBE deutlich sichtbar sind. Multiplizieren Sie dann mit den Verdünnungsfaktor anwesend, um die Anzahl der Bakterien pro Fliege berechnen. Durchzuführen Sie statistische Analysen. Wo nötig, verwandeln die KBE pro Flug nach einer Normalverteilung. Zu diesem Zweck Log-Transformation. Sobald umgewandelt, verallgemeinerte lineare Modelle (quantifizierten)30,31,32 zum Testen verwenden Sie wie die Behandlungsgruppen in KBE pro Fliege (mit handelsüblichen statistischen Software-Pakete wie R33) unterscheiden.Hinweis: Die verbleibenden fliegen Homogenat kann zur Messung der Genexpression durch quantitative reverse Transkription PCR (RT-qPCR) Analyse verwendet werden. Das Homogenat in 50 µL RNA Isolierung Reagenz zu beheben, extrahieren RNA und immun gen Titer von RT-qPCR zu quantifizieren (siehe z. B.Gupta und Vale16 für ein detailliertes Protokoll). Der Ausdruck der spezifischen immun gen Transkripte sollte normalisiert auf die Abschrift eines Zimmermädchen-Gens (d.h., rp49) und ausgedrückt, wie eine Falte ändern relativ Kontrolle fliegen mit 2−ΔΔCt Methode31, 32,33,34. 5. Aufnahme Survivorship nach Infektion Infizieren Sie fliegen mündlich wie unter Punkt 4.2 beschrieben. Übertragen Sie die infizierten oder Kontrolle fliegen von ihren jeweiligen Infektion Fläschchen in Standard Lewis Fläschchen und halten Sie in einem Inkubator bei 25 ° C in einer 12 H:12 h Hell-Dunkel-Zyklus (oder Bedingungen gewünscht). Halten Sie fliegen, bis sie tot sind. Die Anzahl von lebenden oder Toten fliegen in jedes Fläschchen täglich oder so oft wie erforderlich. Übertragen Sie die fliegen auf neue Fläschchen alle 5 Tage um die fliegen stecken in der Nahrung zu vermeiden. Präsentieren Sie diese Daten als Kaplan-Meier (KM) überleben Kurven oder bedeuten Sie ± SE proportional überleben Grundstücke. Um zu analysieren die Wirkung der verschiedenen Faktoren und/oder ihre jeweiligen Wechselwirkungen miteinander verwenden ein Statistik-Paket (z. B. das Paket “Überleben” in R33) um eine Überlebensanalyse wie Cox Proportional Gefahren Modell35auszuführen. 6. Messung der bakteriellen Belastung Zum gewünschten Zeitpunkt übertragen Sie eine infizierte Fliege auf einem sterilen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Oberfläche zu sterilisieren die fliegen wie unter Punkt 4.4 beschrieben. Die Fliege zu homogenisieren und Quantifizierung der bakteriellen Belastung unter Verwendung des Protokolls in Schritten 4,5 – 4.10 beschrieben. 7. Messen Sie bakterielle vergießen Das vergießen neben der internen Belastung zu messen. Übertragen Sie nach der Infektion einzelne fliegen auf 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit ~ 50 µL Lewis Medium für 24 h. Entfernen Sie die fliegen für die interne Last-Messung (siehe Schritt 6) und waschen Sie die Rohre mit 100 µL 1 X PBS durch Vortexen stark für 3 s. Messen Sie die KBE in dieser Wäsche durch Ausplattieren auf Nähragar LB mit dem gleichen Protokoll wie 4.6-4.8 beschrieben. Übertragen Sie nach der Infektion einzelne fliegen auf 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit ~ 50 µL Lewis Medium für 24 h. Übertragen Sie den fliegen auf neue Mikrozentrifugenröhrchen mit ~ 50 µL Lewis Medium für eine weitere 24 h waschen kontaminierte Rohre mit 100 µL 1 X PBS durch Vortexen stark für 3 s. Messen Sie die KBE in dieser Wäsche durch Ausplattieren auf Nähragar LB mit dem gleichen Protokoll beschriebenen Schritte 4.6-4.8. Wiederholen Sie die Schritte 7.2 und 7.3 und Rekord fliegen Mortalität bei jeder Übertragung.

Representative Results

Hier präsentieren wir Ihnen anschauliche Ergebnisse aus Experimenten wo D. Melanogaster mündlich mit p. Aeruginosa oder p. Entomophilainfiziert war. Abbildung 2 zeigt die erfolgreiche orale Infektion fliegen nach einer 12 h oder 24 h Exposition gegenüber bakteriellen Kulturen OD600 = 25 und 100 für p. Aeruginosa (Abbildung 2A) und p. Entomophila (Abb. 2 b ” C), beziehungsweise. Abbildung 2 b zeigt die Bedeutung der Verwendung von konzentrierteren Kultur von p. Entomophila, gezeigt durch die Erhöhung der bakteriellen Belastung, wenn Bakterienkulturen höhere optische Dichte fliegen ausgesetzt sind. Männliche und weibliche Oregon R (OreR) fliegen klar p. Aeruginosa Infektion mit der gleichen Rate (Abbildung 3) und die gleiche Anzahl von p. Aeruginosa KBE (Abb. 4A) vergossen. Wenn jedoch infiziert mit p. Entomophila , unterscheiden sich männliche und weibliche OreR fliegen in die Anzahl der Bakterien Schuppen, in einer Weise, die im Laufe der Zeit (Abbildung 4 b) ändert. Männchen und Weibchen sterben von p. Aeruginosa (Abb. 5A) und p. Entomophila (Abb. 5 b) mit unterschiedlicher Geschwindigkeit. Wir sehen auch, dass Dcy Mutanten (die schützende Peritrophic Matrix in den Darm Epithel fehlt) und lustvoll Mutanten (die einen funktionellen IMD immun Weg fehlt), zeigen verminderte Überleben nach p. Entomophila und p. aeruginosa orale Infektion (Abbildung 5). Abbildung 1: Schematische Übersicht der Protokolle zur Messung überleben, vergießen und interne bakterielle Belastung nach oraler Infektion in Drosophila Melanogaster. Eine Illustration von 3 möglichen Experimenten nach oraler Infektion von D. Melanogaster. Messen Sie das “Überleben”, durch das einzelne fliegen auf Fläschchen übertragen ihre infizierte Lebensdauer. “Shedding” durch die Übertragung einzelner Flies auf 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit 50 µL Lewis Medium in der Kappe zu messen. Entfernen Sie nach 24 Stunden in der Röhre die Fliege und Wirbel die Tube mit 100 µL 1 X PBS. Entfernen und Platte diese Lösung auf LB Nähragar, dem bakteriellen Abbau zu berechnen. Das Vergießen in der gleichen Fliege längs, durch Übertragung von fliegen auf frische Röhren mit Lewis Medium in der Kappe nach 24 h, und Waschen und Beschichtung jetzt kontaminierte Rohr zu messen. Eine Fliege “interne Lasten” kann gemessen werden, indem man eine infizierte Fliege, Oberfläche Sterilisieren sie, und vor dem Plattieren schließlich das Homogenat auf Nähragar LB homogenisieren. Dies kann durchgeführt werden, nach dem vergießen gemessen wurde um zu berechnen wie die “interne Lasten” und vergießen korrelieren. Die Fliege Illustration verwendet in dieser Figur wurde ursprünglich durch B. Nuhanen36gezogen. Die Autoren wurden geändert, um das Beispiel Kaplan-Meier-Kurve begleiten die Wikimedia Commons37entnommen wird. Alle anderen Abbildungen sind original. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2: infektiöse Dosis von Bakterien nach oraler Infektion. (A) infektiöse Dosis von männlichen und weiblichen Oregon-R fliegt nach Exposition zu einer Kultur von p. Aeruginosa (OD600 = 25) für 12 h. Der Mittelwert und SE wurden von 3 Rüden und 3 Hündinnen berechnet. (B) infektiöse Dosis von outcrossed Wildtyp Weibchen nach Exposition gegenüber einer der vier Kulturen von p. Entomophila (OD600 = 100, 75, 50 und 25) oder 5 % Saccharose Kontrolllösung für 24 h. Die Statistische Differenz (F3,76 = 18.567, p < 0,001) in die infektiöse Dosis zwischen Exposition Behandlungen ist gekennzeichnet durch unterschiedliche Buchstaben über Bars. Die Mittel wurden von den 5 fliegen für die OD600 berechnet = 0 Dosis und 18-20 für alle anderen Dosen. (C) die infektiöse Dosis von männlichen und weiblichen Oregon-R fliegt nach p. Entomophila Kultur (OD600 = 100) für 24 h. Der Mittelwert und SE wurden von 20 Männer und 20 Frauen berechnet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3: Interne p. Aeruginosa Last fliegen nach oraler Infektion. Mittelwert ± SE bakterielle Belastung der männlichen und weiblichen Oregon-R fliegt nach oraler Infektion mit p. Aeruginosa (OD600 = 25) bis zu 168 h nach der Infektion. Der Mittelwert und SE für jeden Zeitpunkt errechnen sich aus 3 Personen. Eine Fliege interne keimdruck erheblich ändert sich im Laufe der Zeit (p < 0,001). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 4: bakterielle nach oraler Infektion zu vergießen. (A) p. Aeruginosa Schuppen von der gleichen fliegen in Abbildung 3, bis zu 120 h nach der Infektion verwendet. Der Mittelwert und SE wurden von 3 Rüden und 3 Hündinnen berechnet. (B) p. Entomophila Schuppen von männlichen und weiblichen Oregon-R fliegt nach oraler Infektion mit p. Entomophila (OD600 = 100) bis zu 120 h nach der Infektion. Der Mittelwert und SE wurden von 34 Männer und 38 Frauen berechnet. Für p. Aeruginosa und p. Entomophila, die Anzahl der KBE Schuppen von einer Fliege deutlich ändert im Laufe der Zeit (p < 0,001). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 5: Überleben von fliegen nach mündlichen Bakterieninfektion. Kaplan-Meier (KM) überleben Kurven von (A) Oregon-R männlich und weiblich fliegt nach oraler Infektion mit p. Aeruginosa (OD600 = 25) oder 5 % Saccharose Kontrolllösung. Die KM überleben Kurve wurde von 4 Fläschchen von 20 fliegen pro Behandlungsgruppe berechnet. (B) OreR männliche und weibliche fliegt nach oraler Infektion mit p. Entomophila (OD600 = 100). Die KM überleben Kurve wurde aus 4 einzelnen Steuerelements fliegen und 34 infizierten fliegen für Männer und Frauen berechnet. (C) immun Mutanten: Dcy (Drosocrystallin-Peritrophic-Matrix-Mutante) und Rel (Relish-IMD Mutante), p. Entomophila (Pe), p. Aeruginosa (Pa14) oder Saccharose Kontrolllösung 5 % ausgesetzt. Alle infizierten Gruppen sterben deutlich schneller als das Steuerelement fliegt (p < 0,001). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für zuverlässig mündlich D. Melanogaster mit bakteriellen Krankheitserregern zu infizieren. Wir konzentrieren uns auf p. Aeruginosa und p. Entomophila, aber dieses Protokolls kann leicht angepasst, Infektion von anderen bakteriellen Spezies, z.B. Serratia Marcescens7. ermöglichen werden Schwerpunkte dieses Protokolls variiert zwischen Bakterienarten. Dementsprechend sollten die effizienteste infektiöse Dosis, entsprechende Virulenz und Host Genotyp Anfälligkeit alle in Betracht gezogen und im Idealfall in Pilotstudien getestet. Fliegt zum Bakterienkulturen eine Reihe von optischen Dichte auszusetzen und Messen ihre infektiöse Dosis und das Überleben ist ein geeigneter Ausgangspunkt beim Arbeiten mit neuen Bakterienarten oder Leinen negativ beeinflussen.

Protokoll-Schritte wie Fliegen Hunger vor der Fütterung und erneute Aussetzung bakterielle Pellets in 5 % Saccharoselösung sind an der Tagesordnung in orale Infektion und erhöhen die Zuverlässigkeit der bakteriellen Infektion während der Belichtung7,8, 9 , 10. es ist jedoch wichtig zu beachten, dass während der Belichtung, fliegen im Wesentlichen auf einer Fläche von bakteriellen Kultur Leben. In den Prozess der zu Fuß auf diese Kultur, Bakterien werden sich auf die Fliege Oberfläche, vor allem auf die Nagelhaut oder um die Borsten24untergebracht. Diese epikutikulären Bakterien, eine erfolgreiche Enterische Infektion nicht widerspiegeln, sondern würde immer noch durch die Fliege Homogenisierung und Beschichtung nachgewiesen werden. Um das Potenzial für Fehlalarme zu reduzieren, es ist wichtig, Oberfläche fliegen durch Eintauchen in 70 % igem Ethanol für bis zu 1 min zu sterilisieren.

Bei der bakteriellen vergießen Preise ist oraler Infektion unerlässlich. Die Anzahl der Erreger, die ein Host in die Umgebung freigibt ist oft schwer zu messen und die interne Belastung wird oft als Proxy für die Schwere der Infektion und daher Getriebe26,27genommen. Mess bakterielle Belastung neben bakteriellen Abbau ermöglicht die Untersuchung des Verhältnisses zwischen diesen zwei wichtigen Komponenten der Krankheit schwere und Ausbreitung38. Eine Einschränkung der vorgestellten Methode ist, dass Prüfung der internen bakteriellen Belastung von fliegen destruktive Probenahme erfordert. Dies erschwert die longitudinale Tendenzen der Erreger Wachstum und Freiraum innerhalb der gleichen Person zu untersuchen. Es ist jedoch möglich, diese Beschränkung durch destruktiv Probenahme Kohorten von Personen in verschiedenen Stadien der Infektion, unter der Annahme zu überwinden, dass die durchschnittliche Mikrobe Last in jeder Kohorte die longitudinale Erreger Dynamik in einem bestimmten widerspiegelt einzelnen. Bakteriellen Abbau leidet nicht die gleichen Einschränkungen, und wir bieten Beispiele wie vergießen quantifiziert werden kann in einer Cross-Sectional Probe oder längs zu untersuchen, wie vergießen innerhalb eines Individuums im Laufe der Zeit verändert.

Viele Gastgeber und Erreger Charakterzüge bestimmen gemeinsam eine individuelle Neigung zur Krankheit25,26,39übertragen. Während die Bedeutung dieser Eigenschaften wahrscheinlich zwischen Wirt-Pathogen-Systeme variiert, ist vergießen wahrscheinlich ein wichtiger Faktor der fäkal-orale Übertragung. Die Fähigkeit, bakteriellen Abbau Messen eröffnet die Möglichkeit, diese Annahme zu testen. Haben gekennzeichnet Wirt-Pathogen-Dynamik in einem gewünschten Panel von Fliegenschnüre, könnte Experimentatoren Oral infizieren Menschen und legen Sie sie neben nicht infizierten, anfällig für Gastgeber während ihrer ansteckenden Perioden. Diese “Empfänger” fliegen könnte dann für interne bakterielle Belastung zu verschiedenen Zeitpunkten als eine Methode zur Messung direkt Übertragung untersucht werden.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch eine strategische Award vom Wellcome Trust für das Zentrum für Immunität, Infektion und Evolution (Http://ciie.bio.ed.ac.uk; Grant Referenz Nr. 095831) unterstützt. PFV wurde unterstützt durch eine Branco Weiss Fellowship (https://brancoweissfellowship.org/) und des Kanzlers Fellowship (School of Biological Sciences, University of Edinburgh); JASJ wurde von einem NERC E3 DTP PhD Zugehörigkeit unterstützt.

Materials

Vials Sarstedt Ltd. 58.490 Polystyrene flat base tube 75mm x 23.5mm, 23ml
Agar Sigma-Aldrich A7002 Agar, ash 2.0-4.5%
Brown sugar Bidvest 66032 Light brown soft sugar
Maize Dove's Farm Organic maize flour
Fermipan yeast Bidvest 96360 Dry, instant yeast
Methyl-4-hydroxybenzoate Sigma-Aldrich H5501 >=99.0%, crystalline
Sucrose Sigma-Aldrich 84097 Sucrose BioUltra, for molecular biology, >=99.5% (HPLC)
Petri dishes Fisher Scientific UK Ltd. 15788517 X600 Petri Dish 90 X 16.2MM Sterile Triple Vent
Falcon tubes (50ml) Greiner Bio-one Inc 210261 Centrifuge tube, 50ml, skirted, bagged, sterile
Eppendorf tube (0.5ml) Sarstedt Ltd. 72.699 Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 0.5ml Standard Neutral
Eppendorf tube (1.5ml) Sarstedt Ltd. 72.690.001 Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 1.5ml Standard Neutral
Ethanol VWR International Ltd. 20821.33 ETHANOL ABSOLUTE ANALAR NP ACS/R.PE – Analytical Grade
2 L Conical Flask VWR International Ltd. 214-0038 Narrow neck, 2 L Erlenmeyer flask
Sterile filter paper Fisher Scientific UK Ltd. 1001-020 Plain circle and sheets; Particle Retention: greater than11um; Filtration speed: 150 herzberg; Air flow: 10.5s/100mL/in2; Medium porosity; Smooth surface; Grade 1; Type: circle; Dia: 20mm
Bijou sample container Fisher Scientific UK Ltd. 129A 7ml polystyrene sample container
Pseudomonas isolation agar Sigma-Aldrich 17208 Contains agar 13.6 g/L, magnesium chloride 1.4 g/L, peptic digest of animal tissue 20g/L, potassium sulfate 10g/L, triclosan 0.025g/L
LB broth, Miller Fisher Scientific UK Ltd. BP1426 Contains 10g tryptone, 5g yeast extract, 10g sodium chloride per litre
Large Embryo Collection Cages Scientific Laboratory Supplies Ltd. 59-101 Flystuff- fits 100mm petri dish
TRI reagent solution Life Technologies AM9738
96-well microplate Scientific Laboratory Supplies Ltd. 353072 Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Polystyrene Cell Culture Microplate with Lid Sterile
Pestle Fisher Scientific UK Ltd 12649595 Pestle, Presterilized; Axygen; Tissue grinder; Blue; Inert polypropylene construction; Fits 1.5 and 2.0mL centrifuge tubes; Individually wrapped; 100/Pk
Glycerol Scientific Laboratory Supplies Ltd. CHE2068 Glycerol A.R. 99.5% 2.5 L
Cotton wool- non absorbent Cowens Ltd ABL Non Absorbent Large quantity 20 bags x 500
Cotton wool- absorbent Cowens Ltd ABS BP small quantity 20 bags x 500
Vortex Fisherbrand Whirlimixer 75W 50-6-Hz 220-240V
Orbital incubator Gallenkamp INR-200-010V 220 V, 50 Hz, 5 A. Nominal temperature: 70ºC. Shaking frequency: 0…400 rpm.
Absorbance Microplate Reader Biotek Instruments Ltd ELx808™ Absorbance Microplate Reader
Gen 5 Microplate Reader and Imager Software Biotek Instruments Ltd For Absorbance Microplate Reader
Centrifuge Beckman Coulter 392304 Allegra X-12R Benchtop Centrifuge, refridgerated 50Hz 230V
Step One Plus Real Time qPCR System Thermofisher Scientific 4376600 Applied biosystems Step One Plus real time qPCR system
Step One Software 2.3 Thermofisher Scientific For Stepone and SteponePlus real time qPCR systems
R Statistical Software https://cran.r-project.org/
10 µL pipette tips Greiner Bio-one Inc 741015 Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs
200 µL pipette tips Greiner Bio-one Inc 741065 Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs
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1000 µL filtered pipette tips Greiner Bio-one Inc 740288 Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 60pcs
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Siva-Jothy, J. A., Prakash, A., Vasanthakrishnan, R. B., Monteith, K. M., Vale, P. F. Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (135), e57676, doi:10.3791/57676 (2018).
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