口腔の細菌感染とキイロショウジョウバエの開口

1. ハエを維持します。 はえたてのルイス ・媒体の 7 mL を含む 23 mL プラスチック バイアルを保持 (参照31; から変更 1 L トリプル蒸留 H2O、6.1 g 寒天、93.6 g ブラウン シュガー、68 g のトウモロコシ、18.7 g インスタント酵母、15 mL Tegosept 抗真菌剤) インキュベーターで25 ± 1 ° C、12 h:12 h: 明暗サイクル 〜 60% の湿度。非吸収性綿バイアルを接続します。 すべての 14 日後産卵するように 2-3 日のために、表面に追加、インスタント乾燥酵母を新しい食品バイアルに 20-30 の大人を転送します。この期間の経過後、卵が食品の表面に表示されることを確認します。大人のハエを削除します。注: これは一世代、年齢をマッチさせた集団としてバイアルにハエを保ちます。 開発する卵を残します。注: 25 ° C では、成虫が蛹から 11 日目に eclose を開始、日 12-14 以上継続します。 2. 実験ハエを準備します。 (ミックス ドライ イーストと酵母ペースト普及 (1 L トリプル蒸留 H2O、寒天 30 g、33 g のショ糖、330 mL アップル ジュース、7 mL Tegosept 抗真菌剤) 75 mL リンゴ寒天プレート上人口/胚コレクション ケージで親世代の卵を収集します。ピーナッツ バターのような一貫性に水)。湿気を提供してケージに水に浸した脱脂綿を追加します。注: 幼虫飼育密度の違いによって引き起こされる効果を交絡を避けるため、重要です別の瓶で実験ハエが同じような密度で飼育されていること。上記の手順を実行して、効果を交絡を避けます。 12 h:12 h 25 ° C で 24 時間インキュベート: 明暗サイクルまで産卵が発生しました。24 h 後もいくつかの卵がある場合は、馴化期間を提供します。リンゴ寒天プレートを交換、産卵さらに 24 h のため発生することができます。 人口ケージから卵を含んだリンゴ寒天プレートを取る。寒天培地の表面から残りの酵母のペーストと、死んだハエを削除します。 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 の 20 mL の寒天培地の水没、優しく細かい絵筆でリンゴ寒天から卵を取り除きます。PBS で中断している間は、50 mL の遠心管に卵を転送し、卵が底に沈むので 5 分おきます。注: ほとんどの卵は寒天の外縁にあります。 P1000 フィルター ピペット先端 4 mm 下部を切断することによって削除し、ピペット チップを使用して 50 mL の遠心管の下部から溶液 1 mL を描きます。1.5 mL 遠心チューブにこれを転送し、解決することができます。注: 卵をピペッティング時スナップ解放プランジャーが優しくリリースするよりも効率的です。 P20 フィルター ピペット先端 4 mm 下部を切断することによって削除します。ピペットを希望の音量に設定し、遠心管の底から描画します。注: 練習では、5 μ L のボリュームは約 100 個の卵を含まれます。 収集した卵には、食品を省略し、必要な時間だけを開発するそれらを残します。 3. 細菌培養 P. entomophilaと膿の文化を成長し、30 ° C で凍結の細菌の在庫の 100 μ L とルリア ベルターニカミラ (LB) スープの 10 mL を接種する (P. entomophila) 、37 ° C (膿)、それぞれ。一晩 150 rpm で横に振る。細菌文化が飽和段階に達することを確認します。 ハエを接種用菌は指数段階で、次の朝目的のボリュームの新しいサブカルチャーに一晩かけて培養に接種急速に複製するように。事前接種サブカルチャー文化の総量の 10% であることを確認します。注: 経口感染症は高い必要があります。したがって、必要な線量と実験的サイズの十分な接種の文化を作り出すことができるので、大量の細菌培養を成長する必要は。計算式 MsVsを使用して必要な感染用量を生成する必要がどのくらいのサブカルチャーは = M私V私M がカルチャを表しますを表しますの 600 nm (外径600) 値と V で測定の光学密度がそのボリューム。下付き文字は、サブカルチャー (s) または (i) 感染用量としてカルチャを使用するかどうかを参照してください。 サブカルチャーの表面に収まってフラスコの斜面の先頭 (せいぜい) ちょうどそのボリュームに 2 L の三角フラスコでのこのサブカルチャーを成長します。細菌の増殖を阻害すると、このマークの上記入しないでください。 OD 30 分毎に測定することにより、指数関数的成長段階にこのサブカルチャーの中の細菌を確認します。注: これはサブカルチャーが 0.6-0.8 間 OD600に達する 3-5 h 後発生します。 遠沈管 50 mL でこのサブカルチャーの平等なボリュームを注ぐし、細菌を餌に 4 ° C で 15 分間 2,500 x g でサブカルチャーをスピンします。ペレット、一度削除し、細菌の大半の削除を確認する上記の条件で再び上澄みをスピンします。注: ごくわずかなサイズ (高さ 1 mm より小さい) のペレットはこれを確認します。 再培養上清中のサブカルチャーの 5 mL に懸濁し、1 つ 50 mL のチューブでこれらのソリューションを再結合して個別のチューブの細菌のペレットを組み合わせます。この濃縮培養で細菌をペレットへの 4 ° C で 15 分間 2,500 x g をスピンします。 上澄みを除去し、再 5% ショ糖水溶液で最終的な細菌ペレットを中断します。外径を確認し、目的の伝染性の線量を調整 (外径600 p. entomophila8と OD600 100 = =膿16,2825)、5% でペレットを再懸濁で必要量、スクロース水溶液。注: 追加する 5% ショ糖水溶液の量計算できます 3.2.1 の手順で数式を使用して (MsVs M私V私を =)。 4. 経口感染ハエ 確実に経口感染症を細菌への露出の前に 2-4 h のハエをハエを標準寒天培地瓶 (1 L トリプル蒸留液 7 mL Tegosept 抗真菌剤 84 g ブラウン シュガー、寒天 20 g H2O) に転送することによって餓死します。 ハエが不足している間は、感染のバイアルを準備します。緑膿菌感染症バイアル標準糖寒天の 500 μ L 分注を行う 7 mL のサンプル チューブの蓋に、乾燥させておきます。蓋に濾紙ディスクを置くし、フィルター ディスク上に直接細菌培養の 100 μ L をピペットします。、感染症制御のため、細菌の培養を 5% ショ糖水フィルター紙の上の同じボリュームに置き換えます。 サンプル チューブに単一のハエを追加し、18-24 h のまま。 経口感染を確認、まず細菌の露出の直後にハエの表面殺菌、20-30 米の 70% のエタノールの 100 μ L にそれらを置くことによって削除しエタノール、追加 100 μ L トリプルの蒸留水 20-30 秒の水を削除する前に。1 × pbs 100 μ L を追加し、フライを均質化します。 96 ウェル プレートの一番上の行にホモジュネートを転送し、1x PBS の 90 μ L を下回るごとに追加します。 連続範囲の CFU 値を区別するためにこのサンプルを希釈します。トップまあの磨砕液の 10 μ L を取る、これをよく下記に追加します。この手順を繰り返します 2 番目のも、まあ、第三に 10 μ L を転送するように、必要に応じて、できるだけ多くのシリアル希薄.注: それは希釈液の各セットに新しいピペット チップを使用することが重要。 全て滴残る離散を保障する、5 μ L の LB 寒天プレートにシリアルの希薄をプレートします。 P. entomophilaの膿、それぞれ 30 ° C と 37 ° C で一晩 LB 寒天プレートを孵化させなさいそして表示 CFUs をカウントします。注:ショウジョウバエ腸内細菌には、明確な嫌気性成長条件が必要ですが、選択培地、たとえば緑膿菌分離培地 (PIM) はシュードモナスCFUs のみが数えられるかどうかを確認する使用ことがあります。 10-60 CFUs がはっきり見えるシリアル希釈で現在のコロニーの数を数えることによってフライあたり CFUs の数を計算します。フライあたりの細菌数を計算するための希釈倍率を乗算します。 統計分析を実行します。必要に応じて、正規分布へ飛ぶあたり CFUs を変換します。ログ変換によってこれを行います。変換されると、どの試験治療グループによって異なりますが CFUs のフライ (R33など、一般に利用できる統計ソフトウェア パッケージを使用して) をテストする一般化線形モデル (GLMs)30,31,32を使用します。注: 残りのフライ ホモジネートは、定量的逆転写 PCR (RT qPCR) 解析による遺伝子発現を測定に使用できます。RNA 分離試薬を 50 μ l 添加の磨砕液を修正、RNA の抽出、Rt-qpcr によって特定の遺伝子で免疫抗体を定量化 (例えば、見なさい詳細なプロトコルのグプタとベールの16 )。特定の免疫遺伝子転写の表現を (すなわちrp49) ハウスキーピング遺伝子の転写レベルを正規化し、倍変更 2−ΔΔCt法31を使用してコントロールのハエを基準として表現する必要があります。 32,33,34。 5. 記録生存感染 ハエに 4.2 の手順で説明されているように経口感染します。 感染を転送または標準ルイス バイアルおよび 25 ° c 12 h:12 h でインキュベーターで明暗を維持に、それぞれ感染バイアルからコントロール ハエ サイクル (または条件を希望)。彼らは死んでいるまでにハエを保ちます。 各バイアルは毎日、または必要に応じて、生活や死者のハエの数をカウントします。 食べ物で立ち往生ハエを避けるために 5 日ごと新しい瓶にハエを転送します。 (KM) カプラン ・ マイヤー生存曲線としてこれらのデータを表示または平均 ± SE 比例生存プロットします。分析するには、いくつかの要因と互いにそれぞれの相互作用の効果は Cox 比例ハザード モデル35など生存分析を実行する統計パッケージ (たとえば、パッケージ R33の「サバイバル」) を使用します。 6. 細菌負荷の測定 希望の時間の時点で、1 つの感染したフライを滅菌 1.5 mL 遠心チューブに転送します。 4.4 の手順で説明するよう、表面はハエを滅菌します。 フライを均質化して 4.5-4.10 の手順で説明されているプロトコルを使用して細菌負荷を定量化します。 7. 測定細菌を流して 内部の負荷と一緒に放出を測定します。 感染後 24 h のためのルイス ・媒体の 〜 50 μ L を含む 1.5 mL 遠心チューブに単一のハエを転送します。 内部負荷測定のハエを削除する (手順 6 参照) 3 頻繁にボルテックスの 1 × PBS 100 μ L で管を洗うと s。 めっきが LB 寒天 4.6-4.8 の手順で説明されているように同じプロトコルを使用してこの洗浄の CFUs を測定します。 感染後 24 h のためのルイス ・媒体の 〜 50 μ L を含む 1.5 mL 遠心チューブに単一のハエを転送します。 3 頻繁にボルテックスによってさらに 24 時間の洗浄のためのルイス ・媒体の 〜 50 μ L を含む新しいマイクロ遠心チューブ用の 1 × PBS 100 μ L に汚染されたチューブ ハエに転送 s。 めっきが LB 寒天 4.6-4.8 の手順で同じプロトコルを使用してこの洗浄の CFUs を測定します。 7.2 と 7.3 とレコード フライ死亡すべての転送手順を繰り返します。