Сверхнизкое ввода геном последовательность подготовки библиотеки от Tardigrade единичная
Summary
Большой проблемой остается загрязнение в ходе секвенирования геномных микроскопических организмов. Здесь мы покажем способ последовательности генома тихоходки от одного образца с всего лишь 50 pg геномной ДНК без усиления весь геном свести к минимуму риск загрязнения.
Abstract
Тихоходки являются микроскопических животных, которые переходят в состояние ametabolic, называется anhydrobiosis, когда сталкиваются усыхание и может вернуться к их первоначальное состояние, когда вода поставляется. Геномные последовательности микроскопических животных, таких как тихоходок риски бактериального загрязнения, что иногда приводит к ошибочной интерпретации, например, о масштабах горизонтальный перенос генов в этих животных. Здесь мы предоставляем сверхнизких метод ввода последовательности генома тихоходки, Hypsibius dujardini, от одного образца. Применяя строгие мытья и загрязнения изоляции наряду с эффективной добычи 50 ~ 200 pg геномной ДНК от одного лица, мы построили библиотеку виртуализации с помощью инструмента секвенирования ДНК. Эти библиотеки были весьма воспроизводимые и объективной, и информатики анализ последовательного читает с других геномов H. dujardini показал минимальное количество загрязнения. Этот метод может быть применен к unculturable тихоходок, которые не могут быть виртуализации с помощью предыдущих методов.
Introduction
Тихоходки являются микроскопических животных, которые могут вводить состояние ametabolic, называется anhydrobiosis, когда сталкиваются усыхания. Они восстановить путем поглощения воды1,2. В ametabolic состоянии тихоходки способны терпеть различных экстремальных средах, которые включают экстремальных температур3 и давления4,5, высокие дозы ультрафиолетового света6, рентгеновские и гамма-лучи 7 , 8и9космического пространства. Геномных данных является необходимой основой для изучения молекулярных механизмов anhydrobiosis.
Предыдущие попытки последовательности генома тихоходок показали признаки бактериального загрязнения10,11,12,,1314. Геномные последовательности от таких малых организмов требуется большое количество животных и подвержен бактериального загрязнения; Таким образом мы создали ранее последовательности протокол, с помощью сверхнизких метода ввода, начиная от единичная тихоходки, чтобы свести к минимуму риск загрязнений15. Используя эти данные, мы также провели ампликонов высокого качества и сборка генома H. dujardini16,17. Здесь мы подробно описать этот метод геномной последовательности от отдельного tardigrade ()рис. 1). Проверка этого метода секвенирования находится за пределами фокус этой бумаги и уже тщательно обсуждались в наших предыдущих доклада16.
Этот метод состоит из двух частей: изоляции одного тихоходки с самые низкие возможные загрязнения и извлечение высокое качество пиктограммы уровней ДНК. Тихоходки голодали и тщательно промыть водой, а также антибиотики и наблюдается под микроскопом с 500 кратном обеспечить устранение любых бактериального загрязнения. Предыдущие оценки и измерения показывают, что одного человека тихоходки содержит приблизительно 50-200 pg геномной ДНК16, который добывается путем крекинга хитин экзоскелет циклов замораживания оттаивания или ручной гомогенизации. Этот геномной ДНК представлен библиотеки строительных и виртуализации на инструменте секвенирования ДНК. Дополнительные информатики анализ показывает последовательность высокого качества, а также низкий уровень загрязнения по сравнению с предыдущими проектами tardigrade последовательности.
Protocol
Representative Results
Discussion
Бактериальное загрязнение представляет собой угрозу для геномные последовательности микроскопических организмов. В то время как предыдущие исследования на tardigrade генома отфильтрованы загрязнения, используя обширные информатики методы12,20, мы последов?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят за их техническую поддержку в области секвенирования геномных Nozomi Абэ, Юки Такаи и Уэхаси Исии. Эта работа была поддержана субсидий для японского общества для поощрения науки (JSP) научный сотрудник, KAKENHI субсидий для молодых ученых (No.22681029) и KAKENHI субсидий для научных исследований (B), № 17 H 03620 от JSP-страницы, по Грант для основных научно исследовательских проектов от Sumitomo фонда (No.140340) и частично путем исследования средств от правительства префектуры Ямагата и город Цуруока, Япония. Chlorella vulgaris используется для корма тихоходок была предоставлена любезно хлореллы Industry Co. LTD.
Materials
| SZ61 microscope | OLYMPUS | ||
| BactoAgar | Difco Laboratories | 214010 | |
| Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco by life technologies | 15140-148 | |
| VHX-5000 System | Keyence | ||
| 0.2mL Silicone coating tube | Bio Medical Science | BC-bmb20200 | |
| Quick-DNA Microprep Kit | ZYMO Research | D3021 | Use of this kit is absolutey critical; see step 3.1 |
| 1.5 mL microtube | greiner bio-one | 616-201 | See 4.1.1 |
| HIgh speed refrigerated micro centrifuge | TOMY | MX-307 | |
| Covaris M220 | Covaris Inc. | 4482277 | |
| ThruPLEX DNA-Seq kit | Rubicon Genomics | CAT. NO. R400406 | Use of this kit is absolutey critical; see step 4.2 |
| Thermal Cycler | Bioer Technology | TC-96GHbC | |
| AMPure XP reagent | BECKMAN COULTER Life Science | A63881 | |
| Ethanol | Wako | 054-027335 | |
| EB buffer | QIAGEN | 19086 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2965AA | |
| D1000 Reagents | Agilent | 5067-5583 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| Qubit dsDNA BR Buffer/Reagent | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| Cubee Mini-Centrifuge | RecenttecGenereach | R5-AQBD01aqbd | |
| MiSeq 600 cycle v3 | Illumina Inc. | MS-102-3003 | |
| MiSeq Sequencer | Illumina Inc. | SY-410-1003 |
References
- Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Crowe, L. M. Anhydrobiosis. Annual Review of Physiology. 54 (1), 579-599 (1992).
- Mobjerg, N., et al. Survival in extreme environments – on the current knowledge of adaptations in tardigrades. Acta Physiologica. 202 (3), 409-420 (2011).
- Becquerel, P. La suspension de la vieau dessous de 1/20 K absolu par demagnetization adiabatique de L’alun de fer dans le vide les plus eléve. Comptes Rendus de l’Académie des Sciences. 231, 261-264 (1950).
- Ono, F., et al. Effect of ultra-high pressure on small animals, tardigrades and Artemia. Cogent Physics. 3 (1), 1167575 (2016).
- Horikawa, D. D., et al. Tolerance of anhydrobiotic eggs of the Tardigrade Ramazzottius varieornatus to extreme environments. Astrobiology. 12 (4), 283-289 (2012).
- Horikawa, D. D., et al. Analysis of DNA repair and protection in the Tardigrade Ramazzottius varieornatus and Hypsibius dujardini after exposure to UVC radiation. PLoS One. 8 (6), e64793 (2013).
- Horikawa, D. D., et al. Radiation tolerance in the tardigrade Milnesium tardigradum. International Journal of Radiation Biology. 82 (12), 843-848 (2006).
- May, R. M., Maria, M., Gumard, J. Action différentielle des rayons x et ultraviolets sur le tardigrade Macrobiotus areolatus, a L’état actif et desséché. Bulletin Biologique de la France et de la Belgique. 98, 349-367 (1964).
- Jonsson, K. I., Harms-Ringdahl, M., Torudd, J. Radiation tolerance in the eutardigrade Richtersius coronifer. International Journal of Radiation Biology. 81 (9), 649-656 (2005).
- Bemm, F., Weiss, C. L., Schultz, J., Forster, F. Genome of a tardigrade: Horizontal gene transfer or bacterial contamination?. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3054-E3056 (2016).
- Delmont, T. O., Eren, A. M. Identifying contamination with advanced visualization and analysis practices: metagenomic approaches for eukaryotic genome assemblies. PeerJ. 4, e1839 (2016).
- Koutsovoulos, G., et al. No evidence for extensive horizontal gene transfer in the genome of the tardigrade Hypsibius dujardini. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (18), 5053-5058 (2016).
- Boothby, T. C., Goldstein, B., et al. Reply to Bemm et al. and Arakawa: Identifying foreign genes in independent Hypsibius dujardini genome assemblies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3058-E3061 (2016).
- Boothby, T. C., et al. Evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (52), 15976-15981 (2015).
- Arakawa, K. No evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3057 (2016).
- Arakawa, K., Yoshida, Y., Tomita, M. Genome sequencing of a single tardigrade Hypsibius dujardini individual. Scientific Data. 3, 160063 (2016).
- Yoshida, Y., et al. Comparative genomics of the tardigrades Hypsibius dujardini and Ramazzottius varieornatus. PLoS Biology. 15 (7), e2002266 (2017).
- He, F. Total RNA Extraction from C. elegans. Bio-protocol. Bio101, e47 (2011).
- Andrews, S. . FastQC a quality-control tool for high-throughput sequence data. , (2015).
- Hashimoto, T., et al. Extremotolerant tardigrade genome and improved radiotolerance of human cultured cells by tardigrade-unique protein. Nature Communications. 7, 12808 (2016).
- Zimin, A. V., et al. The MaSuRCA genome assembler. Bioinformatics. 29 (21), 2669-2677 (2013).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Okonechnikov, K., Conesa, A., Garcia-Alcalde, F. Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 32 (2), 292-294 (2016).
- Horikawa, D. D., et al. Establishment of a rearing system of the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus: a new model animal for astrobiology. Astrobiology. 8 (3), 549-556 (2008).
