Bassissimo ingresso il sequenziamento del genoma libreria preparazione da un singolo esemplare di Tardigrade
Summary
Contaminazione durante il sequenziamento genomico di organismi microscopici rimane un grande problema. Qui, vi mostriamo un metodo per sequenziare il genoma di un Tardigrada da un singolo esemplare con appena 50 pg di DNA genomic senza amplificazione intero genoma per ridurre al minimo il rischio di contaminazione.
Abstract
I tardigradi sono animali microscopici che entri in uno stato di ametabola anhydrobiosis chiamato fronte di essiccazione e può tornare al loro stato originale quando l’acqua è fornita. Il sequenziamento genomico di microscopici animali come i tardigradi rischi la contaminazione batterica che a volte porta a interpretazioni errate, ad esempio, per quanto riguarda il limite di trasferimento genico orizzontale in questi animali. Qui, forniamo un metodo di input ultrabasso per sequenziare il genoma di Tardigrada, Hypsibius dujardini, da un singolo esemplare. Impiegando rigorosa esclusione di lavaggio e contaminante insieme ad un’efficiente estrazione del 50 ~ 200 pg DNA genomico da un singolo individuo, abbiamo costruito una biblioteca sequenziata con uno strumento di sequenziamento del DNA. Queste librerie sono state altamente riproducibile e imparziale, e un’analisi informatica della sequenza si legge con altri genomi di H. dujardini ha mostrato una quantità minima di contaminazione. Questo metodo può essere applicato per i tardigradi saggiati che potrebbero non essere sequenziati utilizzando metodi precedenti.
Introduction
I tardigradi sono animali microscopici che possono entrare in uno stato di ametabola chiamato anhydrobiosis quando essiccazione di fronte. Recuperano dall’assorbimento di acqua1,2. Nello stato ametabola, i tardigradi sono in grado di tollerare i vari ambienti estremi, quali temperature estreme pressioni e3 4,5, un alto dosaggio di luce ultravioletta6, raggi x e raggi gamma 7 , 8e9di spazio cosmico. Dati genomici sono un fondamento indispensabile per lo studio dei meccanismi molecolari della anhydrobiosis.
Precedenti tentativi di sequenziare il genoma di tardigradi hanno mostrato segni di contaminazione batterica10,11,12,13,14. Sequenziamento genomico da tali piccoli organismi richiede un gran numero di animali ed è soggetto a contaminazione batterica; di conseguenza, abbiamo precedentemente stabilito un protocollo di sequenziamento utilizzando un metodo di input ultrabasso a partire da un singolo esemplare di Tardigrada, per ridurre al minimo il rischio di contaminazioni15. Utilizzando questi dati, abbiamo condotto ulteriormente una nuova sequenza di alta qualità e riassemblaggio del genoma di H. dujardini16,17. Qui descriviamo in dettaglio questo metodo di sequenziamento genomico da un singolo individuo tardigrade (nella figura 1). La convalida di questo metodo di sequenziamento è oltre il focus di questo lavoro e già è stata accuratamente esaminata nella nostra precedente relazione16.
Questo metodo è composto di due parti: l’isolamento di un singolo Tardigrada con il più basso possibile di contaminazione, l’estrazione di alta qualità dei livelli di pittogramma del DNA. Il Tardigrada è affamato e sciacquare accuratamente con acqua, così come gli antibiotici e osservato sotto un microscopio con ingrandimento X 500 per garantire la rimozione di qualsiasi contaminazione batterica. Misurazioni e stime precedenti indicano che un singolo individuo di Tardigrada contiene circa il 50-200 pg di genomic DNA16, che viene estratta per cracking l’esoscheletro di chitina dai cicli di gelo-disgelo o di omogeneizzazione manuale. Il DNA di genomic è presentato alla costruzione della libreria e sequenziato su uno strumento di sequenziamento del DNA. Un’analisi informatica ulteriori Mostra sequenziamento di alta qualità, così come i bassi livelli di contaminazione rispetto ai precedenti progetti di sequenziamento tardigrade.
Protocol
Representative Results
Discussion
Contaminazione batterica rappresenta una minaccia per il sequenziamento genomico di organismi microscopici. Mentre gli studi precedenti sul sequenziamento del genoma tardigrade hanno filtrato contaminazione utilizzando metodi informatica vasto12,20, abbiamo sequenziato il genoma da un singolo individuo per ridurre al minimo il rischio di contaminazioni. Poiché un singolo Tardigrada contiene circa il 50-200 pg di genomic DNA16 ed è racchi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Nozomi Abe, Yuki Takai e Nahoko Ishii per il loro supporto tecnico nel sequenziamento genomico. Quest’opera è stata sostenuta di sovvenzione per la società del Giappone per la promozione della scienza (JSPS) Research Fellow, sovvenzione dai KAKENHI per giovani scienziati (No.22681029) e KAKENHI sovvenzione per la ricerca scientifica (B), no. 17 H 03620 da JSP, da un Sovvenzione per progetti di ricerca di scienza base da The Sumitomo Foundation (No.140340) e in parte da fondi di ricerca dal governo della Prefettura di Yamagata e città di Tsuruoka, Giappone. Chlorella vulgaris utilizzata per alimentare i tardigradi è stato fornito per gentile concessione di clorella Industry Co. Ltd.
Materials
| SZ61 microscope | OLYMPUS | ||
| BactoAgar | Difco Laboratories | 214010 | |
| Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco by life technologies | 15140-148 | |
| VHX-5000 System | Keyence | ||
| 0.2mL Silicone coating tube | Bio Medical Science | BC-bmb20200 | |
| Quick-DNA Microprep Kit | ZYMO Research | D3021 | Use of this kit is absolutey critical; see step 3.1 |
| 1.5 mL microtube | greiner bio-one | 616-201 | See 4.1.1 |
| HIgh speed refrigerated micro centrifuge | TOMY | MX-307 | |
| Covaris M220 | Covaris Inc. | 4482277 | |
| ThruPLEX DNA-Seq kit | Rubicon Genomics | CAT. NO. R400406 | Use of this kit is absolutey critical; see step 4.2 |
| Thermal Cycler | Bioer Technology | TC-96GHbC | |
| AMPure XP reagent | BECKMAN COULTER Life Science | A63881 | |
| Ethanol | Wako | 054-027335 | |
| EB buffer | QIAGEN | 19086 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2965AA | |
| D1000 Reagents | Agilent | 5067-5583 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| Qubit dsDNA BR Buffer/Reagent | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| Cubee Mini-Centrifuge | RecenttecGenereach | R5-AQBD01aqbd | |
| MiSeq 600 cycle v3 | Illumina Inc. | MS-102-3003 | |
| MiSeq Sequencer | Illumina Inc. | SY-410-1003 |
References
- Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Crowe, L. M. Anhydrobiosis. Annual Review of Physiology. 54 (1), 579-599 (1992).
- Mobjerg, N., et al. Survival in extreme environments – on the current knowledge of adaptations in tardigrades. Acta Physiologica. 202 (3), 409-420 (2011).
- Becquerel, P. La suspension de la vieau dessous de 1/20 K absolu par demagnetization adiabatique de L’alun de fer dans le vide les plus eléve. Comptes Rendus de l’Académie des Sciences. 231, 261-264 (1950).
- Ono, F., et al. Effect of ultra-high pressure on small animals, tardigrades and Artemia. Cogent Physics. 3 (1), 1167575 (2016).
- Horikawa, D. D., et al. Tolerance of anhydrobiotic eggs of the Tardigrade Ramazzottius varieornatus to extreme environments. Astrobiology. 12 (4), 283-289 (2012).
- Horikawa, D. D., et al. Analysis of DNA repair and protection in the Tardigrade Ramazzottius varieornatus and Hypsibius dujardini after exposure to UVC radiation. PLoS One. 8 (6), e64793 (2013).
- Horikawa, D. D., et al. Radiation tolerance in the tardigrade Milnesium tardigradum. International Journal of Radiation Biology. 82 (12), 843-848 (2006).
- May, R. M., Maria, M., Gumard, J. Action différentielle des rayons x et ultraviolets sur le tardigrade Macrobiotus areolatus, a L’état actif et desséché. Bulletin Biologique de la France et de la Belgique. 98, 349-367 (1964).
- Jonsson, K. I., Harms-Ringdahl, M., Torudd, J. Radiation tolerance in the eutardigrade Richtersius coronifer. International Journal of Radiation Biology. 81 (9), 649-656 (2005).
- Bemm, F., Weiss, C. L., Schultz, J., Forster, F. Genome of a tardigrade: Horizontal gene transfer or bacterial contamination?. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3054-E3056 (2016).
- Delmont, T. O., Eren, A. M. Identifying contamination with advanced visualization and analysis practices: metagenomic approaches for eukaryotic genome assemblies. PeerJ. 4, e1839 (2016).
- Koutsovoulos, G., et al. No evidence for extensive horizontal gene transfer in the genome of the tardigrade Hypsibius dujardini. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (18), 5053-5058 (2016).
- Boothby, T. C., Goldstein, B., et al. Reply to Bemm et al. and Arakawa: Identifying foreign genes in independent Hypsibius dujardini genome assemblies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3058-E3061 (2016).
- Boothby, T. C., et al. Evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (52), 15976-15981 (2015).
- Arakawa, K. No evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3057 (2016).
- Arakawa, K., Yoshida, Y., Tomita, M. Genome sequencing of a single tardigrade Hypsibius dujardini individual. Scientific Data. 3, 160063 (2016).
- Yoshida, Y., et al. Comparative genomics of the tardigrades Hypsibius dujardini and Ramazzottius varieornatus. PLoS Biology. 15 (7), e2002266 (2017).
- He, F. Total RNA Extraction from C. elegans. Bio-protocol. Bio101, e47 (2011).
- Andrews, S. . FastQC a quality-control tool for high-throughput sequence data. , (2015).
- Hashimoto, T., et al. Extremotolerant tardigrade genome and improved radiotolerance of human cultured cells by tardigrade-unique protein. Nature Communications. 7, 12808 (2016).
- Zimin, A. V., et al. The MaSuRCA genome assembler. Bioinformatics. 29 (21), 2669-2677 (2013).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Okonechnikov, K., Conesa, A., Garcia-Alcalde, F. Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 32 (2), 292-294 (2016).
- Horikawa, D. D., et al. Establishment of a rearing system of the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus: a new model animal for astrobiology. Astrobiology. 8 (3), 549-556 (2008).
