הגנום קלט ultralow רצף ספריית הכנה מ להצטננות Tardigrade
Summary
זיהום במהלך רצף גנומית של אורגניזמים מיקרוסקופיים עדיין בעיה גדולה. כאן, אנו מראים שיטה רצף הגנום של דובוני מים מן להצטננות עם עמוד 50 קטנה כמו של ה-DNA גנומי ללא הגברה הגנום כולו כדי למזער את הסיכון של זיהום.
Abstract
Tardigrades הם בעלי חיים מיקרוסקופיים להיכנס למצב של ametabolic נקרא anhydrobiosis מול לייבוש והוא יכול להחזיר למצב המקורי שלהם כשהם מסופקים המים. רצף גנומית של בעלי חיים מיקרוסקופיים כמו tardigrades סיכוני זיהום חיידקי שמוביל לפעמים פירושים מוטעים, לדוגמה, בנוגע להיקף של העברה גנטית אופקית בבעלי חיים אלה. כאן, אנו מספקים שיטת קלט ultralow את רצף הגנום של דובוני מים, Hypsibius dujardini, מן להצטננות. על ידי שימוש קפדני הדרה כביסה ולא מזהם יחד עם ניסיון חילוץ יעיל שנות ה-50 ~ 200 pg DNA גנומי של אדם יחיד, ואנחנו נבנה ספריה רציף עם כלי עריכה ברצף ה-DNA. ספריות אלה היו מוטים הדירים מאוד, ניתוח אינפורמטיקה הקריאות ברצף עם הגנום dujardini ה אחרים הראו כמות מזערית של זיהום. בשיטה זו ניתן ליישם tardigrades unculturable זה יכול לא להיות רציף בשיטות קודמות.
Introduction
Tardigrades הם בעלי חיים מיקרוסקופיים יכולים להזין את מצב ametabolic הנקרא anhydrobiosis מול לייבוש. הם לשחזר על-ידי ספיגת מים1,2. במצב ametabolic, tardigrades מסוגלים לנקוט בסביבות קיצוניות שונות, הכוללות טמפרטורות קיצוניות3 ו לחצים4,5, מינון גבוה של אור אולטרה סגול6, צילומי רנטגן, קרני גמא 7 , 8, חלל היקום9. נתונים גנומית היא יסוד חיוני לצורך המחקר של המנגנונים המולקולריים של anhydrobiosis.
נסיונות קודמים רצף הגנום של tardigrades הראו סימנים של זיהום בקטריאלי10,11,12,13,14. רצף גנטי של אורגניזמים קטנים כזה דורש מספר רב של בעלי חיים, והוא נוטה זיהום בקטריאלי; לכן, קודם לכן הקמנו פרוטוקול רצף באמצעות שיטת קלט ultralow החל להצטננות דובוני מים, כדי למזער את הסיכון מציג15. באמצעות נתונים אלו, יש נוספת ערכנו למיין שוב באיכות גבוהה ועל ההרכבה מחדש של הגנום של16, dujardini ה17. כאן נתאר בפירוט שיטה זו עבור רצף גנטי של אדם יחיד tardigrade (איור 1). האימות של שיטה זו הוא מעבר המוקד של המאמר, כבר המורכב בהרחבה בדוח הקודם שלנו16.
שיטה זו מורכבת משני חלקים: בידודו של דובוני מים יחיד עם הכי נמוך שאפשר זיהום, החילוץ באיכות גבוהה של pictogram רמות ה-DNA. דובוני מים מורעבים, לשטוף ביסודיות עם מים, כמו גם אנטיביוטיקה, שנצפו תחת מיקרוסקופ עם 500 X הגדלה כדי להבטיח סילוק כל זיהום חיידקי. הערכות קודמות ומדידות מראים כי אדם יחיד של דובוני מים מכיל כ- 50-200 pg גנומית דנ א16, אשר מופק על ידי פיצוח שלד חיצוני כיטין מחזורים ההקפאה-הפשרה או על ידי המגון ידנית. את הדנ א הגנומי נאספו ספריית לבנייה, וסודרו על מכשיר רצף ה-DNA. ניתוח נוסף אינפורמטיקה מציג רצף באיכות גבוהה, כמו גם רמות נמוכות של זיהום לעומת פרוייקטים רצף tardigrade קודמים.
Protocol
Representative Results
Discussion
זיהום חיידקי מהווה איום על רצף גנומית של אורגניזמים מיקרוסקופיים. בעוד מחקרים קודמים על רצף הגנום tardigrade סינון החוצה זיהום תוך שימוש נרחב אינפורמטיקה שיטות12,20, ריצפנו את הגנום של אדם יחיד כדי למזער את הסיכון של מציג. כיוון דובוני מים בודדים מכיל כ- 50-200 pg דנ א ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים Nozomi אייב, יוקי Takai ו- Nahoko אישיאי על שלהם תמיכה טכנית ב רצף גנטי. עבודה זו נתמכה על ידי מענק הסיוע עבור החברה יפן עבור עמית מחקר של קידום המדע (JSPS), מענק הסיוע KAKENHI למדענים צעירים (No.22681029), KAKENHI מענק הסיוע עבור מדעי למחקר (B), מספר 17 H 03620 JSPS, על ידי גרנט עבור פרויקטים מחקריים מדע בסיסי מן הקרן Sumitomo (No.140340), באופן חלקי על ידי קרנות מחקר ממשלת המחזו איוו ג’ימה, העיר Tsuruoka, יפן. כלורלה דלקתית נהגה לתת את tardigrades סופק באדיבות כלורלה תעשיית ושות’ בע מ
Materials
| SZ61 microscope | OLYMPUS | ||
| BactoAgar | Difco Laboratories | 214010 | |
| Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco by life technologies | 15140-148 | |
| VHX-5000 System | Keyence | ||
| 0.2mL Silicone coating tube | Bio Medical Science | BC-bmb20200 | |
| Quick-DNA Microprep Kit | ZYMO Research | D3021 | Use of this kit is absolutey critical; see step 3.1 |
| 1.5 mL microtube | greiner bio-one | 616-201 | See 4.1.1 |
| HIgh speed refrigerated micro centrifuge | TOMY | MX-307 | |
| Covaris M220 | Covaris Inc. | 4482277 | |
| ThruPLEX DNA-Seq kit | Rubicon Genomics | CAT. NO. R400406 | Use of this kit is absolutey critical; see step 4.2 |
| Thermal Cycler | Bioer Technology | TC-96GHbC | |
| AMPure XP reagent | BECKMAN COULTER Life Science | A63881 | |
| Ethanol | Wako | 054-027335 | |
| EB buffer | QIAGEN | 19086 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2965AA | |
| D1000 Reagents | Agilent | 5067-5583 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| Qubit dsDNA BR Buffer/Reagent | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| Cubee Mini-Centrifuge | RecenttecGenereach | R5-AQBD01aqbd | |
| MiSeq 600 cycle v3 | Illumina Inc. | MS-102-3003 | |
| MiSeq Sequencer | Illumina Inc. | SY-410-1003 |
References
- Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Crowe, L. M. Anhydrobiosis. Annual Review of Physiology. 54 (1), 579-599 (1992).
- Mobjerg, N., et al. Survival in extreme environments – on the current knowledge of adaptations in tardigrades. Acta Physiologica. 202 (3), 409-420 (2011).
- Becquerel, P. La suspension de la vieau dessous de 1/20 K absolu par demagnetization adiabatique de L’alun de fer dans le vide les plus eléve. Comptes Rendus de l’Académie des Sciences. 231, 261-264 (1950).
- Ono, F., et al. Effect of ultra-high pressure on small animals, tardigrades and Artemia. Cogent Physics. 3 (1), 1167575 (2016).
- Horikawa, D. D., et al. Tolerance of anhydrobiotic eggs of the Tardigrade Ramazzottius varieornatus to extreme environments. Astrobiology. 12 (4), 283-289 (2012).
- Horikawa, D. D., et al. Analysis of DNA repair and protection in the Tardigrade Ramazzottius varieornatus and Hypsibius dujardini after exposure to UVC radiation. PLoS One. 8 (6), e64793 (2013).
- Horikawa, D. D., et al. Radiation tolerance in the tardigrade Milnesium tardigradum. International Journal of Radiation Biology. 82 (12), 843-848 (2006).
- May, R. M., Maria, M., Gumard, J. Action différentielle des rayons x et ultraviolets sur le tardigrade Macrobiotus areolatus, a L’état actif et desséché. Bulletin Biologique de la France et de la Belgique. 98, 349-367 (1964).
- Jonsson, K. I., Harms-Ringdahl, M., Torudd, J. Radiation tolerance in the eutardigrade Richtersius coronifer. International Journal of Radiation Biology. 81 (9), 649-656 (2005).
- Bemm, F., Weiss, C. L., Schultz, J., Forster, F. Genome of a tardigrade: Horizontal gene transfer or bacterial contamination?. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3054-E3056 (2016).
- Delmont, T. O., Eren, A. M. Identifying contamination with advanced visualization and analysis practices: metagenomic approaches for eukaryotic genome assemblies. PeerJ. 4, e1839 (2016).
- Koutsovoulos, G., et al. No evidence for extensive horizontal gene transfer in the genome of the tardigrade Hypsibius dujardini. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (18), 5053-5058 (2016).
- Boothby, T. C., Goldstein, B., et al. Reply to Bemm et al. and Arakawa: Identifying foreign genes in independent Hypsibius dujardini genome assemblies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3058-E3061 (2016).
- Boothby, T. C., et al. Evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (52), 15976-15981 (2015).
- Arakawa, K. No evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3057 (2016).
- Arakawa, K., Yoshida, Y., Tomita, M. Genome sequencing of a single tardigrade Hypsibius dujardini individual. Scientific Data. 3, 160063 (2016).
- Yoshida, Y., et al. Comparative genomics of the tardigrades Hypsibius dujardini and Ramazzottius varieornatus. PLoS Biology. 15 (7), e2002266 (2017).
- He, F. Total RNA Extraction from C. elegans. Bio-protocol. Bio101, e47 (2011).
- Andrews, S. . FastQC a quality-control tool for high-throughput sequence data. , (2015).
- Hashimoto, T., et al. Extremotolerant tardigrade genome and improved radiotolerance of human cultured cells by tardigrade-unique protein. Nature Communications. 7, 12808 (2016).
- Zimin, A. V., et al. The MaSuRCA genome assembler. Bioinformatics. 29 (21), 2669-2677 (2013).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Okonechnikov, K., Conesa, A., Garcia-Alcalde, F. Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 32 (2), 292-294 (2016).
- Horikawa, D. D., et al. Establishment of a rearing system of the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus: a new model animal for astrobiology. Astrobiology. 8 (3), 549-556 (2008).
