Electroquímico detección de deuterio cinético isótopo efecto en extracelular transporte de electrones en la Shewanella oneidensis MR-1
Summary
Aquí presentamos un protocolo de los experimentos electroquímicos celulares para estudiar la contribución del transporte de protones a la velocidad de transporte de electrones extracelular a través de los citocromos de la membrana externa de Shewanella oneidensis MR-1.
Abstract
Directa detección electroquímica de c-tipo complejos citocromo incrustados en la membrana externa bacteriana (membrana externa c-tipo complejos citocromo; OM c– Cyts) recientemente ha surgido como un método de análisis de celulares nuevos para caracterizar el transporte de electrones bacteriano de la cadena respiratoria al exterior de la célula, conocido como el transporte de electrones extracelular (EET). Mientras que la vía y cinética del flujo del electrón durante la reacción de EET se han investigado, un método electroquímico de la célula entera para examinar el impacto del transporte de cationes asociado con EET todavía no se ha establecido. En el presente estudio, se describe un ejemplo de una técnica bioquímica para examinar el efecto de cinética isótopos de deuterio (KIE) sobre EET mediante OM c– Cyts usando un microbio modelo, Shewanella oneidensis MR-1. El KIE en el proceso EET puede obtenerse si la OTA a través de OM c– Cyts actúa como el paso tarifa-limitador en la actual producción microbiana. Para ello, antes de la adición de D2O, la solución sobrenadante fue reemplazada con medio fresco que contiene una cantidad suficiente de la donante del electrón para apoyar la tasa de reacciones metabólicas por aguas arriba y para eliminar las células planctónicas de un uniforme monocapa biofilm en el electrodo de trabajo. Métodos alternativos para confirmar la limitación de velocidad se paso en actual producción microbiana como EET mediante OM c– Cyts también se describen. Nuestra técnica de un análisis electroquímico de células completas para investigar la cinética del transporte de protones se puede aplicar a otras cepas microbianas electroactivos.
Introduction
Recientemente han surgido técnicas electroquímicas para caracterizar directamente una proteína redox en una célula bacteriana intacta desde el descubrimiento del metal reduciendo las cepas microbianas, como Geobacter sulfurreducens PCA, S. oneidensis MR-1 que tienen complejos de citocromo tipo c de membrana externa (OM c-Cyts) expuestos a la célula exterior1,2,3,4,5. El OM c– Cyts mediar transporte de electrones de la cadena respiratoria a sustratos sólidos situados extracelularmente. Este transporte se denomina transporte de electrones extracelular (EET)1,6 y es un proceso crítico para las biotecnologías emergentes, tales como las células de combustible microbianas6. Por lo tanto, para comprender la cinética subyacente de EET y mecanismos y su relación con la fisiología microbiana, OM c –Cyts han investigado usando celulares electroquímica4,7, combinado con microscopía 8 , 9, espectroscopia10,11y biología molecular2,4. En contraste, los métodos para investigar el impacto del transporte de cationes asociados de EET, por ejemplo, protones, en la cinética de la EET en las células vivas apenas establecidos, a pesar de transporte de protones a través de las membranas bacterianas tienen un papel fundamental señalización, homeostasis y energía producción12,13,14. En el presente estudio, describimos una técnica para examinar el impacto del transporte de protones en la cinética de la EET en la S. oneidensis MR-1 célula usando células completas medidas electroquímicas, que requiere la identificación del paso tarifa-limitador en la microbiana de producción actual15.
Una forma directa de evaluar la contribución del transporte de protones en la OTA asociada es efecto cinético del isótopo deuterio (KIE). El KIE es observable como el cambio en la cinética de transferencia de electrones sobre el reemplazo de protones con los iones de deuterio, que representa el impacto del transporte del protón en electrón transferencia cinética16. La teoría de KIE sí mismo se ha establecido bien con medidas electroquímicas de enzimas purificadas17. Sin embargo, ya que la producción actual en S. oneidensis MR-1 resultado de múltiples procesos diversos y fluctuantes18, uno no puede simplemente identificar EET como el proceso de limitación de velocidad. Para observar el KIE en procesos de transporte de protones junto con EET, tenemos que confirmar que la actual producción microbiana está limitada por el transporte de electrones a través de OM c– Cyts al electrodo. Para ello, sustituimos la solución sobrenadante con medio fresco que contiene una alta concentración de lactato como un donante del electrón en el pH óptimo y la temperatura antes de la medición de KIE; este reemplazo sirve dos funciones: (1) mejora la tasa de los procesos metabólicos por aguas arriba en comparación con la OTA y (2) omite las células de la natación en el sobrenadante del monocapa biofilm de S. oneidensis MR-1 en el (electrodo de trabajo electrodos de óxido de estaño dopado (ITO) de indio). El protocolo detallado presentado pretende ayudar a los nuevos profesionales mantener y confirmar que el proceso EET es la etapa de determinación de tasa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nuestro análisis electroquímico de células completas tiene varias ventajas técnicas en comparación con electroquímica de proteína. Mientras que la purificación de proteínas requiere varios pasos lentos procedimientos, nuestro método de celulares toma un día de formación del biofilm auto-organizada después de cultivo celular. Para lograr una interacción estable entre OM c– Cyts y el electrodo, necesitamos sólo la esterilización y limpieza de la superficie del electrodo; no requiere modificación d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado financieramente por un subvenciones de investigación promovido especialmente de la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSPS) KAKENHI número de concesión 24000010, 17H 04969 y JP17J02602, el nos oficina de Naval investigación Global (N62909-17-1-2038). Y.T. es un investigador de JSP y apoyado por JSP a través del programa escuelas de graduados principales (mérito).
Materials
| Glass cylinder | N/A | N/A | Custom-made, used as the electrochemical reactor |
| PTFE cover and base | N/A | N/A | Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor |
| Buthyl rubber | N/A | N/A | Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor |
| Septa | GL Science | 3007-16101 | Used as an injection port of electrochemical reactor |
| Indium tin-doped oxide (ITO) electrode | GEOMATEC | No.0001 | Used as a working electrode, 5Ω/sq |
| Ag/AgCl KCl saturated electrode | HOKUTO DENKO | HX-R5 | Used as a reference electrode, Φ0.30mm |
| Platinum wire | The Nilaco Cooporation | PT-351325 | Used as a counter electrode |
| Luria-Bertani (LB) Broth, Miller | Becton, Dichkinson and Company | 244620 | Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1 |
| Bacto agar | Becton, Dichkinson and Company | 214010 | |
| Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS) | TCI | A1428 | |
| Flavin mononucleotide (FMN) | Wako | 184-00831 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | Used for defined medium (DM) |
| CaCl2 · 2H2O | Wako | 031-00435 | Used for DM |
| NH4Cl | Wako | 011-03015 | Used for DM |
| MgCl2 · 6H2O | Wako | 135-00165 | Used for DM |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Used for DM |
| 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) | DOJINDO | 346-08235 | Used for DM |
| Sodium Lactate Solution | Wako | 195-02305 | |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dichkinson and Company | 212750 | |
| Deuterium oxide (D, 99.9%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-PK | Additive for kinetic isotope effect experiments |
| Incubator | TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. | LTI-601SD | Used for precultivation |
| Shaker | TAITEC | NR-3 | Used for precultivation |
| Autoclave machine | TOMY SEIKO CO. LTD. | LSX-500 | Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium |
| Clean bench | SANYO | MCV-91BNF | Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes |
| Centrifuge separator | Eppendorf | 5430R | Rotational speed upto 6000×g is required |
| Nitrogen gas generator | Puequ CO. LTD. | PNTN-2 | Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator |
| UV-vis spectrometer | SHIMADZU | UV-1800 | Used for optimization of cell density |
| Potentiostat | BioLogic | VMP3 | Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments |
| Thermal water circulator | AS ONE | TR-1A | Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor |
| Faraday cage | HOKUTO DENKO | HS-201S | Used for electrochemical experiments |
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