Электрохимические обнаружения от дейтерия кинетическая изотопный эффект на внеклеточные переноса электронов в Shewanella oneidensis MR-1
Summary
Здесь мы представляем протокол поклеточного электрохимических экспериментов для изучения вклада протонного транспорта по ставке внеклеточного переноса электронов через внешней мембраны цитохромов комплекс в Shewanella oneidensis MR-1.
Abstract
Прямых электрохимических обнаружения c-типа цитохрома комплексы, встроенных в бактериальной внешней мембраны (внешней мембраны c-типа цитохрома комплексов; ОМ c– Cyts) имеет недавно возникла как Роман поклеточного аналитического метода характеризовать бактериальной переноса электронов от дыхательной цепи на улицу клетки, называют внеклеточного переноса электронов (EET). Хотя были исследованы пути и кинетика электронов потока во время реакции EET, поклеточного Электрохимический метод для изучения воздействия транспорта катион, связанные с EET еще не созданы. В настоящем исследовании примером биохимического метода рассмотреть воздействие кинетической изотопа дейтерия (ки) на EET через ом c– Cyts, используя модель микробом, Shewanella oneidensis MR-1, описан. КИ на процесс EET могут быть получены, если EET через ом c– Cyts действует как тариф ограничивая шаг в микробной текущего производства. С этой целью, перед добавлением D2O супернатанта решения был заменен свежие средства массовой информации, содержащие достаточное количество электронов доноров поддержать уровень вверх метаболических реакций и удалить планктонных клетки из единой однослойная биопленки на рабочем электроде. Альтернативные методы для подтверждения ограничения скорости шаг в микробной текущего производства как EET через ом c– Cyts также описаны. Наш метод поклеточного электрохимического анализа для изучения кинетики протонного транспорта может быть применен к другим Электроактивные микробных штаммов.
Introduction
Электрохимические методы непосредственно характеризуют редокс белка в нетронутыми бактериальной клетке недавно появились после обнаружения металла сокращение микробных штаммов, например S. oneidensis MR-1 или Geobacter sulfurreducens СПС, которые имеют внешняя мембрана тип c тситохрома комплексы (ом c-Cyts) подвергается ячейку внешней1,2,3,4,5. ОМ c– Cyts посредником переноса электронов от дыхательной цепи для твердых субстратов внеклеточно расположенных. Этот транспорт называется внеклеточного переноса электронов (EET)1,6 и представляет собой критический процесс для новых биотехнологий, в частности микробные топливные элементы6. Таким образом чтобы понять основной EET кинетики и механизмов и ее связь с микробной физиологии, ом c –Cyts были исследованы с помощью поклеточного электрохимии4,7, в сочетании с микроскопией 8 , 9,10,спектроскопии11и молекулярной биологии2,4. Напротив методы для изучения последствий EET-связаны катионов транспорта, например, протонов, на кинетику EET в живых клетках едва созданы, несмотря на протонного транспорта через бактериальной мембраны, что решающую роль сигнализации, гомеостаза и энергии производство12,,1314. В настоящем исследовании, мы опишем технику для изучения воздействия протонного транспорта на кинетику EET в ячейке S. oneidensis MR-1 с помощью поклеточного электрохимических измерений, которая требует идентификации тариф ограничивая шаг в микробные текущего производства15.
Прямой способ оценить вклад протонного транспорта на связанные EET является эффект кинетическая изотопа дейтерия (ки). КИЕ наблюдается как изменения в кинетика электронов передачи после замена протонов с ионы дейтерия, который представляет воздействия транспорта протон электрон передачи кинетики16. Теория KIE, сама была создана хорошо с использованием электрохимических измерений с очищенной ферментов17. Однако, поскольку текущее производство в S. oneidensis MR-1 результаты из нескольких, разнообразных и меняющихся процессы18, один не может идентифицировать просто EET как процесс ограничения скорости. Соблюдать KIE на Протон транспортных процессов в сочетании с EET, мы должны подтвердить, что микробные текущего производства ограничивается переноса электронов через ом c– Cyts к электроду. Для этой цели мы заменили супернатанта решение с свежей средой, с высокой концентрацией лактата как донора электрона на оптимальный рН и температурные условия перед KIE измерения; Эта замена служил две роли: (1) повысить уровень вверх метаболических процессов, по сравнению с EET и (2) опущены плавательный клетки в надосадке освобожден от биопленки монослоя S. oneidensis MR-1 на рабочих электродом ( Индия легированный оловом оксид (ITO) электрод). Представлен подробный протокол призван помочь новичкам сохранить и подтвердить, что процесс EET курс определение шаг.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наши поклеточного электрохимических пробирного имеет ряд технических преимуществ, по сравнению с белка электрохимии. В то время как очищение протеина требует длительных процедур многоступенчатый, наши поклеточного метод принимает один день самоорганизации биопленки после клеточно?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была финансовой поддержке целевых субсидий для специально поощрять исследования от японского общества для поощрения науки (JSP) номер гранта KAKENHI 24000010, 17H 04969 и JP17J02602, нас управлением военно-морских исследований глобальных (N62909-17-1-2038). Ю.ц. научный сотрудник JSP-страницы и поддерживается JSP-страницы через программы для ведущих выпускников школ (ЗАСЛУГИ).
Materials
| Glass cylinder | N/A | N/A | Custom-made, used as the electrochemical reactor |
| PTFE cover and base | N/A | N/A | Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor |
| Buthyl rubber | N/A | N/A | Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor |
| Septa | GL Science | 3007-16101 | Used as an injection port of electrochemical reactor |
| Indium tin-doped oxide (ITO) electrode | GEOMATEC | No.0001 | Used as a working electrode, 5Ω/sq |
| Ag/AgCl KCl saturated electrode | HOKUTO DENKO | HX-R5 | Used as a reference electrode, Φ0.30mm |
| Platinum wire | The Nilaco Cooporation | PT-351325 | Used as a counter electrode |
| Luria-Bertani (LB) Broth, Miller | Becton, Dichkinson and Company | 244620 | Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1 |
| Bacto agar | Becton, Dichkinson and Company | 214010 | |
| Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS) | TCI | A1428 | |
| Flavin mononucleotide (FMN) | Wako | 184-00831 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | Used for defined medium (DM) |
| CaCl2 · 2H2O | Wako | 031-00435 | Used for DM |
| NH4Cl | Wako | 011-03015 | Used for DM |
| MgCl2 · 6H2O | Wako | 135-00165 | Used for DM |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Used for DM |
| 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) | DOJINDO | 346-08235 | Used for DM |
| Sodium Lactate Solution | Wako | 195-02305 | |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dichkinson and Company | 212750 | |
| Deuterium oxide (D, 99.9%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-PK | Additive for kinetic isotope effect experiments |
| Incubator | TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. | LTI-601SD | Used for precultivation |
| Shaker | TAITEC | NR-3 | Used for precultivation |
| Autoclave machine | TOMY SEIKO CO. LTD. | LSX-500 | Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium |
| Clean bench | SANYO | MCV-91BNF | Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes |
| Centrifuge separator | Eppendorf | 5430R | Rotational speed upto 6000×g is required |
| Nitrogen gas generator | Puequ CO. LTD. | PNTN-2 | Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator |
| UV-vis spectrometer | SHIMADZU | UV-1800 | Used for optimization of cell density |
| Potentiostat | BioLogic | VMP3 | Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments |
| Thermal water circulator | AS ONE | TR-1A | Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor |
| Faraday cage | HOKUTO DENKO | HS-201S | Used for electrochemical experiments |
References
- Nealson, K. H., Saffarini, D. Iron and Manganese in Anaerobic Respiration – Environmental Significance, Physiology, and Regulation. Annu. Rev. Microbiol. 48, 311-343 (1994).
- Bretschger, O., et al. Current production and metal oxide reduction by Shewanella oneidensis MR-1 wild type and mutants. Appl Environ Microb. 73 (21), 7003-7012 (2007).
- Richter, H., et al. Cyclic voltammetry of biofilms of wild type and mutant Geobacter sulfurreducens on fuel cell anodes indicates possible roles of OmcB, OmcZ, type IV pili, and protons in extracellular electron transfer. Energy Environ. Sci. 2 (5), 506-516 (2009).
- Okamoto, A., Nakamura, R., Hashimoto, K. In-vivo identification of direct electron transfer from Shewanella oneidensis MR-1 to electrodes via outer-membrane OmcA-MtrCAB protein complexes. Electrochim. Acta. 56 (16), 5526-5531 (2011).
- Strycharz, S. M., et al. Application of cyclic voltammetry to investigate enhanced catalytic current generation by biofilm-modified anodes of Geobacter sulfurreducens strain DL1 vs. variant strain KN400. Energy Environ. Sci. 4 (3), 896-913 (2011).
- Lovley, D. R. Bug juice: harvesting electricity with microorganisms. Nat. Rev. Microbiol. 4 (7), 497-508 (2006).
- Coursolle, D., Gralnick, J. A. Reconstruction of extracellular respiratory pathways for iron(III) reduction in Shewanella oneidensis strain MR-1. Front. Microbiol. 3, (2012).
- Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environ. Sci. 2 (1), 113-119 (2009).
- McLean, J. S., Ona, O. N., Majors, P. D. Correlated biofilm imaging, transport and metabolism measurements via combined nuclear magnetic resonance and confocal microscopy. ISME J. 2 (2), 121-131 (2008).
- Busalmen, J. P., Esteve-Nunez, A., Berna, A., Feliu, J. M. C-type cytochromes wire electricity-producing bacteria to electrodes. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (26), 4874-4877 (2008).
- Nakamura, R., Ishii, K., Hashimoto, K. Electronic Absorption Spectra and Redox Properties of C Type Cytochromes in Living Microbes. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (9), 1606-1608 (2009).
- Myers, C. R., Nealson, K. H. Respiration-Linked Proton Translocation Coupled to Anaerobic Reduction of Manganese(IV) and Iron(III) in Shewanella putrefaciens MR-1. J. Bacteriol. 172 (11), 6232-6238 (1990).
- Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Extracellular Electron Transport Scarcely Accumulates Proton Motive Force in Shewanella oneidensis MR-1. Bull. Chem. Soc. Jpn. 88 (5), 690-692 (2015).
- Okamoto, A., Tokunou, Y., Saito, J. Cation-limited kinetic model for microbial extracellular electron transport via an outer membrane cytochrome C complex. Biophysics and physicobiology. 13, 71-76 (2016).
- Okamoto, A., Tokunou, Y., Shafeer, K., Hashimoto, K. Proton Transport in the Outer-Membrane Flavocytochrome Complex Limits the Rate of Extracellular Electron Transport. Angew. Chem. Int. Ed. 56, 9082-9086 (2017).
- Hammes-Schiffer, S., Stuchebrukhov, A. A. Theory of Coupled Electron and Proton Transfer Reactions. Chem. Rev. 110 (12), 6939-6960 (2010).
- Cleland, W. W. The use of isotope effects to determine enzyme mechanisms. J Biol. Chem. 278 (52), 51975-51984 (2003).
- Kouzuma, A., Kasai, T., Hirose, A., Watanabe, K. Catabolic and regulatory systems in Shewanella oneidensis MR-1 involved in electricity generation in microbial fuel cells. Front. Microbiol. 6, (2015).
- Kushner, D. J., Baker, A., Dunstall, T. G. Pharmacological uses and perspectives of heavy water and deuterated compounds. Can. J Physiol. Pharm. 77 (2), 79-88 (1999).
- Xie, X. S., Zubarev, R. A. Effects of Low-Level Deuterium Enrichment on Bacterial Growth. Plos One. 9 (7), e102071 (2014).
- Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H., Nakamura, R. Rate enhancement of bacterial extracellular electron transport involves bound flavin semiquinones. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (19), 7856-7861 (2013).
- Edwards, M. J., et al. Redox Linked Flavin Sites in Extracellular Decaheme Proteins Involved in Microbe-Mineral Electron Transfer. Sci. Rep. 5, 11677 (2015).
- Saito, J., Hashimoto, K., Okamoto, A. Flavin as an Indicator of the Rate-Limiting Factor for Microbial Current Production in Shewanella oneidensis MR-1. Electrochim. Acta. 216, 261-265 (2016).
- Guo, J. B., et al. Reduction of Cr(VI) by Escherichia coli BL21 in the presence of redox mediators. Bioresource Technol. 123, 713-716 (2012).
- Nealson, K., Saffarini, D., Moser, D., Smith, M. J. A Spectrophotometric Method for Monitoring Tactic Responses of Bacteria under Anaerobic Conditions. J Microbiol. Meth. 20 (3), 211-218 (1994).
- Myers, C. R., Myers, J. M. Cell surface exposure of the outer membrane cytochromes of Shewanella oneidensis MR-1. Lett. Appl. Microbiol. 37 (3), 254-258 (2003).
- Lower, B. H., et al. Antibody Recognition Force Microscopy Shows that Outer Membrane Cytochromes OmcA and MtrC Are Expressed on the Exterior Surface of Shewanella oneidensis MR-1. Appl. Environ. Microbiol. 75 (9), 2931-2935 (2009).
- Chen, X. X., Ferrigno, R., Yang, J., Whitesides, G. A. Redox properties of cytochrome c adsorbed on self-assembled monolayers: A probe for protein conformation and orientation. Langmuir. 18 (18), 7009-7015 (2002).
- McMillan, D. G. G., et al. The impact of enzyme orientation and electrode topology on the catalytic activity of adsorbed redox enzymes. Electrochim. Acta. 110, 79-85 (2013).
- Dinh, H. T., et al. Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms. Nature. 427 (6977), 829-832 (2004).
- McGlynn, S. E., Chadwick, G. L., Kempes, C. P., Orphan, V. J. Single cell activity reveals direct electron transfer in methanotrophic consortia. Nature. 526 (7574), 531-535 (2015).
- Okamoto, A., Nakamura, R., Nealson, K. H., Hashimoto, K. Bound Flavin Model Suggests Similar Electron-Transfer Mechanisms in Shewanella and Geobacter. Chemelectrochem. 1 (11), 1808-1812 (2014).
- Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H. Flavin Redox Bifurcation as a Mechanism for Controlling the Direction of Electron Flow during Extracellular Electron Transfer. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (41), 10988-10991 (2014).
- Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Acceleration of Extracellular Electron Transfer by Alternative Redox-Active Molecules to Riboflavin for Outer-Membrane Cytochrome c of Shewanella oneidensis MR-1. J Phys. Chem. C. 120 (29), 16168-16173 (2016).
- Rowe, A. R., et al. Tracking electron uptake from a cathode into Shewanella cells: implications for generating maintenance energy from solid substrates. bioRxiv. , 116475 (2017).
