Elektrochemische detectie van Deuterium kinetisch-isotoopeffect op extracellulaire elektronentransport in Shewanella oneidensis heer-1
Summary
Hier presenteren we een protocol van geheel-cel elektrochemische experimenten te bestuderen van de bijdrage van proton vervoer aan het tarief van extracellulaire elektronentransport via de buitenmembraan cytochromes complex in Shewanella oneidensis heer-1.
Abstract
Directe elektrochemische detectie van c-type cytochroom complexen ingebed in de bacteriële buitenmembraan (buitenmembraan c-Typ cytochroom complexen; OM c– Cyts) heeft onlangs naar voren gekomen als een roman geheel-cel analysemethode te karakteriseren de bacteriële elektronentransport uit de luchtwegen keten aan de buitenkant van de cel, hierna aangeduid als de extracellulaire elektronentransport (EET). Terwijl het traject en de kinetiek van de stroom van elektronen tijdens de EET-reactie zijn onderzocht, is een elektrochemische geheel-cell, methode te onderzoeken van de effecten van het vervoer van de catie gekoppeld EET nog niet vastgesteld. In de huidige studie, een voorbeeld van een biochemische techniek te onderzoeken het deuterium kinetisch-isotoopeffect (KIE) op EET t/m OM c– Cyts met behulp van een model-microbe, Shewanella oneidensis heer-1, wordt beschreven. De KIE op het EET-proces kan worden verkregen als de EET t/m OM c– Cyts als de snelheidslimieten stap in de microbiële huidige productie fungeert. Te dien einde, vóór de toevoeging van D2O, werd de bovenstaande oplossing vervangen door verse medium met een voldoende hoeveelheid van de elektronendonor ter ondersteuning van het tempo van de upstream metabole reacties, en te verwijderen van de planktonische cellen van een uniform enkelgelaagde biofilm op de elektrode werken. Alternatieve methoden te bevestigen de snelheidslimieten-stap in microbiële huidige productie als EET t/m OM c– Cyts ook worden beschreven. Onze techniek van een geheel-cel elektrochemische assay voor het onderzoeken van proton vervoer kinetiek kan worden toegepast op andere microbiële stammen van electroactive.
Introduction
Elektrochemische technieken te karakteriseren direct een redox-eiwit in een intact bacteriële cel onlangs naar voren zijn gekomen sinds de ontdekking van metaal-reducerende microbiële stammen, zoals S. oneidensis heer-1 of Geobacter sulfurreducens partnerschaps-en samenwerkingsovereenkomst, die hebben de buitenmembraan cytochroom c-type complexen (OM c-Cyts) blootgesteld aan de cel exterieur1,2,3,4,5. De OM- c– Cyts bemiddelen elektronentransport uit de luchtwegen keten aan vaste substraten gelegen extracellularly. Dit vervoer wordt hierna aangeduid als extracellulaire elektronentransport (EET)1,6 en is een kritiek proces voor opkomende biotechnologie, zoals microbiële brandstofcellen6. Daarom, om te begrijpen van de onderliggende EET-kinetiek en mechanismen, en haar link naar microbiële fysiologie, OM c –Cyts zijn onderzocht met behulp van geheel-cel elektrochemie4,7, gecombineerd met microscopie 8 , 9, spectroscopie10,11, en moleculaire biologie2,4. In tegenstelling, zijn methoden voor het onderzoeken van de effecten van het EET-geassocieerde catie vervoer, bijvoorbeeld protonen, op EET kinetiek in levende cellen nauwelijks vastgesteld, ondanks proton vervoer over bacteriële membranen hebben een cruciale rol signalering, homeostase en energie productie12,13,14. In de huidige studie, beschrijven we een techniek om de onderzoeken van het effect van het proton vervoer op EET kinetiek in de S. oneidensis heer-1 cel met behulp van geheel-cel Electrochemische metingen, waarvoor de identificatie van de snelheidslimieten stap in microbiële huidige productie15.
Een directe manier om de bijdrage van het proton vervoer op de bijbehorende EET is het deuterium kinetisch-isotoopeffect (KIE). De KIE is waarneembaar als de verandering in de elektronen overdracht kinetiek op de vervanging van protonen met deuterium ionen, die de impact van het proton vervoer op elektron overdracht kinetiek16aangeeft. De theorie van KIE zelf is goed opgezet Electrochemische metingen met gezuiverde enzymen17. Echter, aangezien huidige productie in S. oneidensis heer-1 wordt veroorzaakt door meerdere, divers, en schommelende processen18, niet één EET gewoon identificeren als de snelheidslimieten proces. Om te zien hoe de KIE op proton transportprocessen EET wordt gekoppeld, moeten we om te bevestigen dat de microbiële huidige productie wordt beperkt door elektronentransport via OM c– Cyts op de elektrode. Voor dit doel vervangen wij het supernatant oplossing met verse opslagmedium met een hoge concentratie van lactaat als een elektrondonor tegen de optimale pH en temperatuurvoorwaarden voor KIE meting; deze vervanging diende twee rollen: (1) het verbeterd het tarief van de upstream metabole processen ten opzichte van de EET, en (2) de cellen van het zwemmen in het supernatant vrijgelaten uit de biofilm enkelgelaagde van S. oneidensis heer-1 op de werkende elektrode (weggelaten indium tin-doped oxide (ITO) elektrode). De gepresenteerde gedetailleerd protocol is bedoeld om te helpen nieuwe beoefenaars handhaven en bevestigen dat het proces EET de tarief-bepalen stap is.
Protocol
Representative Results
Discussion
Onze geheel-cel elektrochemische bepaling heeft een aantal technische voordelen vergeleken met eiwit elektrochemie. Hoewel eiwitreiniging vereist de multi-step tijdrovende procedures, neemt onze geheel-cell, methode een dag van zelf-georganiseerde biofilm vorming na celkweek. Om te bereiken van een stabiele interactie tussen OM c– Cyts en de elektrode, moeten we alleen sterilisatie en reiniging van het oppervlak van de elektrode; het vereist geen wijziging van de elektrode voor het organiseren van de richting va…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd financieel ondersteund door een Grant-in-Aid voor speciaal bevorderd onderzoek van de vereniging van Japan voor promotie van wetenschap (JSPS) KAKENHI Grant nummer 24000010, 17H 04969, en JP17J02602, de ons kantoor van Naval Research Global (N62909-17-1-2038). Y.T. is een JSPS Research Fellow en ondersteund door JSPS via het programma voor toonaangevende gediplomeerde scholen (MERIT).
Materials
| Glass cylinder | N/A | N/A | Custom-made, used as the electrochemical reactor |
| PTFE cover and base | N/A | N/A | Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor |
| Buthyl rubber | N/A | N/A | Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor |
| Septa | GL Science | 3007-16101 | Used as an injection port of electrochemical reactor |
| Indium tin-doped oxide (ITO) electrode | GEOMATEC | No.0001 | Used as a working electrode, 5Ω/sq |
| Ag/AgCl KCl saturated electrode | HOKUTO DENKO | HX-R5 | Used as a reference electrode, Φ0.30mm |
| Platinum wire | The Nilaco Cooporation | PT-351325 | Used as a counter electrode |
| Luria-Bertani (LB) Broth, Miller | Becton, Dichkinson and Company | 244620 | Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1 |
| Bacto agar | Becton, Dichkinson and Company | 214010 | |
| Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS) | TCI | A1428 | |
| Flavin mononucleotide (FMN) | Wako | 184-00831 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | Used for defined medium (DM) |
| CaCl2 · 2H2O | Wako | 031-00435 | Used for DM |
| NH4Cl | Wako | 011-03015 | Used for DM |
| MgCl2 · 6H2O | Wako | 135-00165 | Used for DM |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Used for DM |
| 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) | DOJINDO | 346-08235 | Used for DM |
| Sodium Lactate Solution | Wako | 195-02305 | |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dichkinson and Company | 212750 | |
| Deuterium oxide (D, 99.9%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-PK | Additive for kinetic isotope effect experiments |
| Incubator | TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. | LTI-601SD | Used for precultivation |
| Shaker | TAITEC | NR-3 | Used for precultivation |
| Autoclave machine | TOMY SEIKO CO. LTD. | LSX-500 | Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium |
| Clean bench | SANYO | MCV-91BNF | Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes |
| Centrifuge separator | Eppendorf | 5430R | Rotational speed upto 6000×g is required |
| Nitrogen gas generator | Puequ CO. LTD. | PNTN-2 | Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator |
| UV-vis spectrometer | SHIMADZU | UV-1800 | Used for optimization of cell density |
| Potentiostat | BioLogic | VMP3 | Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments |
| Thermal water circulator | AS ONE | TR-1A | Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor |
| Faraday cage | HOKUTO DENKO | HS-201S | Used for electrochemical experiments |
References
- Nealson, K. H., Saffarini, D. Iron and Manganese in Anaerobic Respiration – Environmental Significance, Physiology, and Regulation. Annu. Rev. Microbiol. 48, 311-343 (1994).
- Bretschger, O., et al. Current production and metal oxide reduction by Shewanella oneidensis MR-1 wild type and mutants. Appl Environ Microb. 73 (21), 7003-7012 (2007).
- Richter, H., et al. Cyclic voltammetry of biofilms of wild type and mutant Geobacter sulfurreducens on fuel cell anodes indicates possible roles of OmcB, OmcZ, type IV pili, and protons in extracellular electron transfer. Energy Environ. Sci. 2 (5), 506-516 (2009).
- Okamoto, A., Nakamura, R., Hashimoto, K. In-vivo identification of direct electron transfer from Shewanella oneidensis MR-1 to electrodes via outer-membrane OmcA-MtrCAB protein complexes. Electrochim. Acta. 56 (16), 5526-5531 (2011).
- Strycharz, S. M., et al. Application of cyclic voltammetry to investigate enhanced catalytic current generation by biofilm-modified anodes of Geobacter sulfurreducens strain DL1 vs. variant strain KN400. Energy Environ. Sci. 4 (3), 896-913 (2011).
- Lovley, D. R. Bug juice: harvesting electricity with microorganisms. Nat. Rev. Microbiol. 4 (7), 497-508 (2006).
- Coursolle, D., Gralnick, J. A. Reconstruction of extracellular respiratory pathways for iron(III) reduction in Shewanella oneidensis strain MR-1. Front. Microbiol. 3, (2012).
- Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environ. Sci. 2 (1), 113-119 (2009).
- McLean, J. S., Ona, O. N., Majors, P. D. Correlated biofilm imaging, transport and metabolism measurements via combined nuclear magnetic resonance and confocal microscopy. ISME J. 2 (2), 121-131 (2008).
- Busalmen, J. P., Esteve-Nunez, A., Berna, A., Feliu, J. M. C-type cytochromes wire electricity-producing bacteria to electrodes. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (26), 4874-4877 (2008).
- Nakamura, R., Ishii, K., Hashimoto, K. Electronic Absorption Spectra and Redox Properties of C Type Cytochromes in Living Microbes. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (9), 1606-1608 (2009).
- Myers, C. R., Nealson, K. H. Respiration-Linked Proton Translocation Coupled to Anaerobic Reduction of Manganese(IV) and Iron(III) in Shewanella putrefaciens MR-1. J. Bacteriol. 172 (11), 6232-6238 (1990).
- Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Extracellular Electron Transport Scarcely Accumulates Proton Motive Force in Shewanella oneidensis MR-1. Bull. Chem. Soc. Jpn. 88 (5), 690-692 (2015).
- Okamoto, A., Tokunou, Y., Saito, J. Cation-limited kinetic model for microbial extracellular electron transport via an outer membrane cytochrome C complex. Biophysics and physicobiology. 13, 71-76 (2016).
- Okamoto, A., Tokunou, Y., Shafeer, K., Hashimoto, K. Proton Transport in the Outer-Membrane Flavocytochrome Complex Limits the Rate of Extracellular Electron Transport. Angew. Chem. Int. Ed. 56, 9082-9086 (2017).
- Hammes-Schiffer, S., Stuchebrukhov, A. A. Theory of Coupled Electron and Proton Transfer Reactions. Chem. Rev. 110 (12), 6939-6960 (2010).
- Cleland, W. W. The use of isotope effects to determine enzyme mechanisms. J Biol. Chem. 278 (52), 51975-51984 (2003).
- Kouzuma, A., Kasai, T., Hirose, A., Watanabe, K. Catabolic and regulatory systems in Shewanella oneidensis MR-1 involved in electricity generation in microbial fuel cells. Front. Microbiol. 6, (2015).
- Kushner, D. J., Baker, A., Dunstall, T. G. Pharmacological uses and perspectives of heavy water and deuterated compounds. Can. J Physiol. Pharm. 77 (2), 79-88 (1999).
- Xie, X. S., Zubarev, R. A. Effects of Low-Level Deuterium Enrichment on Bacterial Growth. Plos One. 9 (7), e102071 (2014).
- Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H., Nakamura, R. Rate enhancement of bacterial extracellular electron transport involves bound flavin semiquinones. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (19), 7856-7861 (2013).
- Edwards, M. J., et al. Redox Linked Flavin Sites in Extracellular Decaheme Proteins Involved in Microbe-Mineral Electron Transfer. Sci. Rep. 5, 11677 (2015).
- Saito, J., Hashimoto, K., Okamoto, A. Flavin as an Indicator of the Rate-Limiting Factor for Microbial Current Production in Shewanella oneidensis MR-1. Electrochim. Acta. 216, 261-265 (2016).
- Guo, J. B., et al. Reduction of Cr(VI) by Escherichia coli BL21 in the presence of redox mediators. Bioresource Technol. 123, 713-716 (2012).
- Nealson, K., Saffarini, D., Moser, D., Smith, M. J. A Spectrophotometric Method for Monitoring Tactic Responses of Bacteria under Anaerobic Conditions. J Microbiol. Meth. 20 (3), 211-218 (1994).
- Myers, C. R., Myers, J. M. Cell surface exposure of the outer membrane cytochromes of Shewanella oneidensis MR-1. Lett. Appl. Microbiol. 37 (3), 254-258 (2003).
- Lower, B. H., et al. Antibody Recognition Force Microscopy Shows that Outer Membrane Cytochromes OmcA and MtrC Are Expressed on the Exterior Surface of Shewanella oneidensis MR-1. Appl. Environ. Microbiol. 75 (9), 2931-2935 (2009).
- Chen, X. X., Ferrigno, R., Yang, J., Whitesides, G. A. Redox properties of cytochrome c adsorbed on self-assembled monolayers: A probe for protein conformation and orientation. Langmuir. 18 (18), 7009-7015 (2002).
- McMillan, D. G. G., et al. The impact of enzyme orientation and electrode topology on the catalytic activity of adsorbed redox enzymes. Electrochim. Acta. 110, 79-85 (2013).
- Dinh, H. T., et al. Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms. Nature. 427 (6977), 829-832 (2004).
- McGlynn, S. E., Chadwick, G. L., Kempes, C. P., Orphan, V. J. Single cell activity reveals direct electron transfer in methanotrophic consortia. Nature. 526 (7574), 531-535 (2015).
- Okamoto, A., Nakamura, R., Nealson, K. H., Hashimoto, K. Bound Flavin Model Suggests Similar Electron-Transfer Mechanisms in Shewanella and Geobacter. Chemelectrochem. 1 (11), 1808-1812 (2014).
- Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H. Flavin Redox Bifurcation as a Mechanism for Controlling the Direction of Electron Flow during Extracellular Electron Transfer. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (41), 10988-10991 (2014).
- Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Acceleration of Extracellular Electron Transfer by Alternative Redox-Active Molecules to Riboflavin for Outer-Membrane Cytochrome c of Shewanella oneidensis MR-1. J Phys. Chem. C. 120 (29), 16168-16173 (2016).
- Rowe, A. R., et al. Tracking electron uptake from a cathode into Shewanella cells: implications for generating maintenance energy from solid substrates. bioRxiv. , 116475 (2017).
