Eletroquímico deteção de deutério cinética efeito isotópico no transporte de elétrons extracelular em Shewanella oneidensis MR-1
Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo de toda a célula eletroquímicos experimentos para estudar a contribuição do transporte de protões para a taxa de transporte de elétrons extracelular através do membrana externa citocromos complexos em Shewanella oneidensis MR-1.
Abstract
Direto de deteção eletroquímica de c-tipo complexos citocromo embutidos na membrana externa bacteriana (membrana externa c-tipo complexos citocromo; OM c– Cyts) tem recentemente emergiu como um método analítico de células inteiras romance para caracterizar o bacteriano transporte de elétrons da cadeia respiratória para o exterior da célula, referido como o transporte de elétrons extracelular (EET). Enquanto o caminho e a cinética do fluxo de elétrons durante a reação de EET têm sido investigados, um método eletroquímico de células inteiras para examinar o impacto do transporte de cátion associado com EET não ainda foi estabelecido. No presente estudo, um exemplo de uma técnica bioquímica para examinar o efeito de cinética isótopo deutério (KIE) sobre EET através de OM c– Cyts usando um micróbio de modelo, Shewanella oneidensis MR-1, é descrita. A KIE sobre o processo EET pode ser obtido se a EET através de OM c– Cyts atua como o passo limitante na produção atual microbiana. Para o efeito, antes da adição de D2O, o sobrenadante foi substituído com mídia fresca contendo uma quantidade suficiente do doador de elétron para suportar a taxa de upstream reações metabólicas e para remover as células planctônicas de um uniforme monocamada biofilme sobre o eletrodo de trabalho. Métodos alternativos para confirmar o limitante passo na produção atual microbiana como EET através de OM c– Cyts também são descritos. Nossa técnica de um ensaio eletroquímico células inteiras para investigar a cinética de transporte de prótons pode ser aplicada a outras cepas microbianas eletroativos.
Introduction
Surgiram recentemente Técnicas eletroquímicas para caracterizar diretamente uma proteína redox em uma célula bacteriana intacta desde a descoberta de cepas microbianas redução de metal, como S. oneidensis MR-1 ou Geobacter sulfurreducens PCA, que tem complexos de citocromo c-tipo de membrana externa (c-Cyts OM) expostos à célula exterior1,2,3,4,5. O OM c– Cyts mediar o transporte de elétrons da cadeia respiratória para substratos sólidos localizado extracelularmente. Este transporte é referido como transporte de elétrons extracelular (EET)1,6 e é um processo crítico para biotecnologias emergentes, tais como células de combustível microbianas6. Portanto, para entender a cinética EET subjacente e mecanismos e a sua ligação à fisiologia microbiana, OM c –Cyts foram investigados usando toda a célula eletroquímica4,7, combinado com microscopia 8 , 9, espectroscopia de10,11e biologia molecular2,4. Em contraste, métodos para investigar o impacto do transporte de cátion EET-associados, por exemplo, os prótons, na cinética EET em células vivas foram mal estabelecidos, apesar do transporte de protões através das membranas bacterianas, tendo um papel crítico sinalização, homeostase e energia produção12,13,14. No presente estudo, descrevemos uma técnica para examinar o impacto do transporte de prótons na cinética EET em S. oneidensis MR-1 célula usando medições eletroquímicas célula inteira, que requer a identificação da etapa limitante de produção atual de microbiana15.
Uma maneira direta para avaliar a contribuição do transporte de prótons sobre a EET associado é o efeito de cinética isótopo deutério (KIE). A KIE é observável como a mudança na cinética de transferência de elétrons sobre a substituição de prótons com íons de deutério, que representa o impacto do transporte de prótons na transferência de elétrons cinética16. A teoria de KIE em si bem estabeleceu usando medições eletroquímicas com enzimas purificada17. No entanto, desde que a produção atual em S. oneidensis MR-1 resulta do múltiplo, processos diversos e flutuação18, um não pode simplesmente identificar EET como o processo limitante. Para observar o KIE em processos de transporte de prótons juntamente com EET, precisamos confirmar que a atual produção microbiana é limitada pelo transporte de elétrons através de OM c– Cyts para o eletrodo. Para este efeito, substituímos a solução sobrenadante por meio fresco, que contém uma alta concentração de lactato como doador de elétron no pH ideal e as condições de temperatura antes da medição KIE; Esta substituição serviu dois papéis: (1) reforçada a taxa dos processos metabólicos montante em comparação com a EET e (2) omitido as células de natação no sobrenadante libertado o biofilme monocamada de S. oneidensis MR-1 sobre o trabalho do eléctrodo ( eletrodo de estanho dopado com óxido (ITO) índio). O protocolo detalhado apresentado destina-se a ajudar novos praticantes manter e confirmar que o processo EET é o passo determinante de taxa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nosso ensaio eletroquímico de célula inteira tem várias vantagens técnicas em comparação com eletroquímica de proteína. Enquanto a purificação de proteínas requer várias etapas procedimentos demorados, nosso método de célula inteira leva um dia de formação de biofilmes auto-organizado após a cultura de células. Para obter uma interacção estável entre OM c– Cyts e o eletrodo, precisamos apenas de esterilização e limpeza da superfície do eletrodo; não exige modificação de eletrodos para …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado financeiramente por um subsídio para investigação especialmente promovido da sociedade para a promoção da ciência (JSPS) número de concessão KAKENHI 24000010, 17H 04969, Japão e JP17J02602, nos escritório do Naval Research Global (N62909-17-1-2038). Y.T. é um pesquisador de JSPS e apoiado por JSPS através do programa para liderar graduação escolas (mérito).
Materials
| Glass cylinder | N/A | N/A | Custom-made, used as the electrochemical reactor |
| PTFE cover and base | N/A | N/A | Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor |
| Buthyl rubber | N/A | N/A | Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor |
| Septa | GL Science | 3007-16101 | Used as an injection port of electrochemical reactor |
| Indium tin-doped oxide (ITO) electrode | GEOMATEC | No.0001 | Used as a working electrode, 5Ω/sq |
| Ag/AgCl KCl saturated electrode | HOKUTO DENKO | HX-R5 | Used as a reference electrode, Φ0.30mm |
| Platinum wire | The Nilaco Cooporation | PT-351325 | Used as a counter electrode |
| Luria-Bertani (LB) Broth, Miller | Becton, Dichkinson and Company | 244620 | Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1 |
| Bacto agar | Becton, Dichkinson and Company | 214010 | |
| Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS) | TCI | A1428 | |
| Flavin mononucleotide (FMN) | Wako | 184-00831 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | Used for defined medium (DM) |
| CaCl2 · 2H2O | Wako | 031-00435 | Used for DM |
| NH4Cl | Wako | 011-03015 | Used for DM |
| MgCl2 · 6H2O | Wako | 135-00165 | Used for DM |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Used for DM |
| 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) | DOJINDO | 346-08235 | Used for DM |
| Sodium Lactate Solution | Wako | 195-02305 | |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dichkinson and Company | 212750 | |
| Deuterium oxide (D, 99.9%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-PK | Additive for kinetic isotope effect experiments |
| Incubator | TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. | LTI-601SD | Used for precultivation |
| Shaker | TAITEC | NR-3 | Used for precultivation |
| Autoclave machine | TOMY SEIKO CO. LTD. | LSX-500 | Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium |
| Clean bench | SANYO | MCV-91BNF | Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes |
| Centrifuge separator | Eppendorf | 5430R | Rotational speed upto 6000×g is required |
| Nitrogen gas generator | Puequ CO. LTD. | PNTN-2 | Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator |
| UV-vis spectrometer | SHIMADZU | UV-1800 | Used for optimization of cell density |
| Potentiostat | BioLogic | VMP3 | Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments |
| Thermal water circulator | AS ONE | TR-1A | Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor |
| Faraday cage | HOKUTO DENKO | HS-201S | Used for electrochemical experiments |
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