Количественная оценка внутриклеточных роста внутри макрофагов является быстрый и надежный метод оценки вирулентности лейшмании паразитов

Лейшманиоз ссылается на широкий спектр человеческих заболеваний, вызванных простейших паразитов видов рода Leishmania. В настоящее время примерно 12 миллионов человек инфицированы лейшмании во всем мире, и более чем 350 миллионов подвергаются риску. Патологии болезни зависит от видов Leishmania и принимающих факторов, и симптомы варьируются от безобидных самовосстановления поражениях кожи смертоносных visceralizing формы. Если untreated, Висцеральный лейшманиоз является фатальным, рейтинг только после малярии как смертоносных болезней человека, вызванного инфекцией с простейших паразитов¹. Несмотря на широкие различия в патологии заболеваний и симптомов всех видов Leishmania имеют жизненный цикл digenic, чередуя Промастиготы и amastigote этапов внутри насекомых и позвоночных хозяев, соответственно. Внутри позвоночных, лейшмании целевой хост макрофагов для вторжения и вызвать образование parasitophorous вакуоли (PVs), кислой отсеков с свойства фаголизосомах скопирована Высоко вирулентным amastigote формы. Amastigotes сохраняется в тканях хост во время хронической инфекции и может быть передан на неинфицированных москитов, завершая цикл передачи. Таким образом в контексте развития болезней человека, amastigotes являются наиболее важным лейшмании жизненного цикла формы². Расследование, как amastigotes репликацию внутри макрофагов PVs имеет решающее значение для понимания лейшмании вирулентности^3,4,5,6,7 и для Разработка новых эффективных терапии.

Здесь мы описываем метод регулярно используется в нашей лаборатории для изучения лейшмании инфекции и репликации в костный мозг производные макрофагов (BMMs), который включает количественную оценку числа внутриклеточных лейшмании со временем. Этот процесс включает сбор моноциты из костного мозга мыши и дифференцировку макрофагов в культуре, в vitro инфекцию с инфекционный формы (metacyclic promastigotes или amastigotes) Leishmania и количественной оценки количество внутриклеточных паразитов в каждом интервале 24 ч в течение 72-96 ч после инфицирования. В нашей лаборатории был использован этот assay для определения влияния нескольких экологических факторов и паразита генов, включая определение критической роли железа в содействии вирулентности L. amazonensis , который был также подтвержден зверолов исследований развития поражения в мышей^{6,8,9,10,11,12,13,14,15} . Поскольку все патогенных видов Leishmania установить их репликативной нишу внутри узла макрофагов, этот assay может использоваться универсально для вирулентности определений всех видов Leishmania .

Выполнение BMM инфекций позволяет анализ основ паразито хозяинных взаимодействия на уровне отдельной ячейки и таким образом более широкое понимание как лейшмании паразитов взаимодействуют с их предпочтительным разместить микроокружения, PVs макрофагов. Макрофагов инфекцией assays успешно использовались несколько групп^{16,17,18,19,20,,2122} для изучения функции принимающей макрофагов и лейшмании специфических генов и их возможного участия в сложное взаимодействие, которое характеризует внутриклеточную инфекцию. БММ инфекции позволяют квантификации роста паразита как считывание влияния принимающей факторов, которые влияют внутриклеточных выживания, как производство оксида азота бактерицидных, генерации активных форм кислорода и других неблагоприятных условий с которыми внутри Лизосома как PVs²³. Макрофагов инфекции анализов также были использованы для выявления потенциальных наркотиков приводит анти leishmanial для терапевтических развития^13,24.

В vitro характер BMM инфекций обеспечивает несколько преимуществ перед другими методами для оценки лейшмании вирулентности. Однако несколько предыдущих исследований, изучения механизмов выживания внутриклеточный паразит со временем не количественно инфекции как ставка^20,21,24. Кроме того многие исследования сосредоточены на после инфекции в естественных условиях со временем сделал это путем измерения размера кожные поражения и другие физиологические симптомы, которые лишь косвенно связаны с паразитом репликации^{25,26 , 27}. в естественных условиях инфекции является строгий подход к оценке вирулентности возбудителя, но поражения размер измерения на основе зверолов, опухоль в одиночку часто являются неадекватными, поскольку они отражают воспалительной реакции в инфицированных тканях и не абсолютное количество паразитов. По этой причине развитие поражения зверолов анализов должны сопровождаться количественная оценка нагрузки паразита в инфицированных тканях, процедура, которая требует продолжительного ограничения разрежения assays²⁸. Кроме того в vivo исследования часто связаны, жертвуя несколько животных в различные моменты времени для извлечения тканей интерес^6,,^8,9,,^{10, 11 , 13}. В отличие от этого, большое количество BMMs могут быть получены только одно животное, и эти клетки могут быть покрытие в условиях, которые позволяют оценку инфекции в различные моменты времени. Кроме того по сравнению с в vivo исследований, выполняя в vitro BMM инфекций позволяет больший контроль над экспериментальных условиях. Количественная оценка макрофаги быть инфицированы наряду с паразитами, сами позволяет точный контроль кратности инфекции (МВД) и условий, культуры. Точный контроль над этими факторами могут быть ключом в определении характеристики дискретных сотовой пути и в понимании их влияния на ход инфекции.

С учетом этих преимуществ, это несколько удивительно, что очень немногие группы изучения лейшмании вирулентности пока полной мере воспользовались количественной оценки внутриклеточных репликации в макрофагах. В этой статье мы обсудим распространенных ошибок, которые могут быть затрудняет более широкое использование этот assay и предоставляют пошаговые протокол для облегчения ее надлежащего осуществления. Учитывая ее точность и универсальность пробирного BMM инфекции, которую мы опишем здесь могут не только быть использованы для изучения взаимодействия хост патогена, влияющие на лейшманий вирулентности, но и для изучения других микроорганизмов, которые реплицируют внутри макрофаги²⁹. Важно отметить, что этот assay также могут быть разработаны как метод быстрый и экономичный доклинические скрининга для анти leishmanial разработки лекарственных препаратов.