細胞内マクロファージの内部成長の定量化は高速とリーシュ マニア原虫の病原性を評価するための信頼性の高い方法です。

リーシュ マニア症は、原虫リーシュ マニア属の種によって引き起こされる人間の病気の広いスペクトルを指します。約 1200 万人現在リーシュ マニア、世界中に感染しているし、以上 3 億 5000 万が危険にさらされます。病の病理は、リーシュ マニア原虫種と宿主因子によって決まるし、症状が無害な自己治癒皮膚病変から致命的な visceralizing フォームに変わる。最悪の人間の病気としてマラリア後だけランキングが¹原虫感染によって引き起こされる未処理、内臓リーシュ マニア症は致命的な場合。病の病理や症状に多岐にわたる違いがあるにもかかわらずすべてのリーシュ マニア原虫種昆虫内の promastigote と amastigote の段階と脊椎動物のホストをそれぞれ交互 digenic ライフ サイクルがあります。内部脊椎動物、リーシュ マニアホスト マクロファージ浸潤、parasitophorous 液胞 (Pv)、高度病原性 amastigote フォームが複製ファゴライソゾームの特性と酸性コンパートメントの形成を誘導します。Amastigotes 慢性感染の間に宿主組織の永続化および伝送サイクルを完了するに感染していないサシチョウバエを渡されることができます。したがって、人間の病気の開発の中で、amastigotes は、最も重要なリーシュ マニアライフ サイクル フォーム²です。理解リーシュ マニア病原性^3,4,5,6、7のための重要なマクロファージ Pv 内での amastigotes の複製方法の調査は、新規の効果的な治療法の開発。

リーシュ マニア感染や骨髄由来マクロファージ (BMMs)、時間の経過とともに細胞内リーシュ マニア原虫の数の定量的評価を含むレプリケーションを研究する研究室による定期的な利用法をご紹介します。リーシュ マニアの定量化の文化におけるマクロファージに感染フォーム (metacyclic promastigotes または amastigotes)の in vitro感染マウス骨髄と分化から球の収穫には、細胞内寄生虫感染 72 96 h の期間の 24 時間間隔での数です。この試金は、いくつかの環境要因および足蹠でさらに検証されたL. amazonensis病原性の促進に鉄の役割の重要性の識別を含む寄生虫の遺伝子の影響を判断する私たちの研究室で使用されていますマウス^{6,8,9,10、11,12,13,14,15 病変の開発研究}.以来、すべての病原性リーシュ マニア原虫種ホスト マクロファージ内の複製のニッチを確立、この試金はすべてリーシュ マニア原虫種の病原性決定の普遍的に使用できます。

BMM 感染症を実行する単一セルのレベルでホスト寄生虫相互作用の解析とこうしてリーシュ マニア原虫が彼らのホストの優先の微小環境、マクロファージの PVs と対話する方法のより広範な理解ことができます。探索する正常にマクロファージ感染アッセイ複数グループ^{16,17,18,19,20,21,22}で使用されています。ホスト マクロファージや細胞内感染症を特徴付ける複雑な相互作用の彼らの潜在的関与やリーシュ マニア原虫遺伝子の機能。BMM の感染症は、寄生虫としての成長、読み出し殺菌一酸化窒素産生、活性酸素種の生成および他の不利な条件など、細胞の生存に影響を与えるホストの要因の影響の定量化を許可します。ライソソーム様 Pv²³中が発生しました。マクロファージ感染アッセイは、治療開発^13,24の潜在的な抗 leishmanial 薬リードを識別するために利用されています。

BMM 感染症の体外性質は、リーシュ マニア病原性を評価するために他の方法に比べていくつかの利点を提供します。ただし、時間の経過とともに細胞内寄生虫生存のメカニズムを調べるいくつかの以前の研究では、感染率^20,21,24は定量化しなかった。さらに、次の時間をかけて生体内で感染症に焦点を当てた多くの研究によってそう寄生虫レプリケーション^25,26に間接的にのみ関連が他の生理学的な症状や皮膚病変の長さを測る^,27.体内感染寄生生物の毒性を評価するために厳格なアプローチが単独で腫れ足蹠に基づく病変サイズ測定はしばしば不十分で彼らは感染した組織の炎症反応を反映してではなく、寄生虫の絶対数。このため、足蹠ヒメシバの試金が感染した体内寄生虫の負荷の定量化が続いて長い制限希釈を必要とする手順²⁸の試金します。さらに、研究生体内では度々 関心^6,8,9,10,の組織を抽出する時に別のポイントで複数の動物を犠牲にします。^11,13。 対照的に、ちょうど 1 つの動物から得られる BMMs の数が多いと、これらの細胞は、時間の様々 なポイントで感染症の評価を許可する条件の下でめっきすることが。さらに、生体内での研究と比較すると実験条件をより細かく制御 BMM 感染体外を実行できます。寄生虫自身と一緒に感染するマクロファージの定量化は、感染 (MOI) と培養条件の多様性の正確に制御できます。これらの要因を細かく制御は、離散細胞経路の特性を識別する内感染に与える影響を理解する上でのキーをすることができます。

これらの利点を考えると、それはリーシュ マニア病原性を研究する非常に少数グループがマクロファージの細胞内複製の定量的評価をフルに活用を撮影ところやや意外。この資料では、このアッセイのより広範な利用を妨げる、その適切な実施を促進するステップバイ ステップのプロトコルを提供可能性があります一般的な落とし穴について述べる.精度、汎用性を考慮してここで述べる BMM 感染試験ないのみ利用できるリーシュ マニア病原性に影響を及ぼす宿主-病原体相互作用を探索する内で複製その他の微生物の研究にもマクロファージ²⁹。重要なは、この試金は反 leishmanial 医薬品開発の迅速かつ経済的な前臨床スクリーニング法としても開発できます。