Quantificação de crescimento intracelular dentro de macrófagos é um rápido e confiável método para avaliar a virulência de Leishmania parasitas

Leishmaniose refere-se a um amplo espectro de doenças humanas causadas por espécies de parasitas protozoários do gênero Leishmania. Atualmente, cerca de 12 milhões de pessoas estão infectados com Leishmania em todo o mundo, e mais de 350 milhões estão em risco. A patologia da doença depende da espécie de Leishmania e fatores do hospedeiro, e sintomas variam de lesões de pele de auto-recuperação inócuo para formas visceralizing letais. Se leishmaniose visceral, não tratada é fatal, classificação somente depois da malária, como a doença mais mortal humana causada pela infecção por um protozoário parasita¹. Apesar das diferenças amplas na patologia da doença e sintomas, todas as espécies de Leishmania têm um digenic-ciclo de vida alternando entre fases amazonensis e amastigotas no interior do inseto e hospedeiros vertebrados, respectivamente. Dentro vertebrados, Leishmania alvo macrófagos do hospedeiro para invasão e induzem a formação de vacúolos parasitophorous (PVs), compartimentos ácidos com propriedades de fagolisossomas onde replicam as formas amastigotas altamente virulento. Amastigotes persistir nos tecidos do hospedeiro durante infecções crônicas e podem ser passados para a frente não infectados flebotomíneos, completando o ciclo de transmissão. Portanto, no contexto do desenvolvimento de doenças humanas, amastigotes são o mais importante de formulário do ciclo de vida Leishmania ². Investigar como amastigotes replicar dentro macrófago PVs é fundamental para a compreensão de Leishmania virulência^3,4,5,6,7 e para o desenvolvimento de novas terapias eficazes.

Descrevemos aqui um método usado regularmente por nosso laboratório para estudar a infecção de Leishmania e replicação em macrófagos derivados da medula óssea (BMMs), que envolve a avaliação quantitativa do número de intracelular Leishmania ao longo do tempo. O processo envolve a colheita de monócitos da medula óssea de rato e diferenciação de macrófagos na cultura, na vitro infecção com formas infectantes (promastigotas metacyclic ou amastigotes) de Leishmania e quantificação do número de parasitas intracelulares em cada intervalo de 24 h, por um período de 72-96 h após a infecção. Este ensaio tem sido usado em nosso laboratório, para determinar o impacto de diversos fatores ambientais e os genes do parasita, incluindo a identificação do papel crítico de ferro na promoção têm L. virulência que mais foi validada por Whitney estudos de desenvolvimento de lesão em ratos^{6,8,9,10,11,12,13,14,15} . Desde que todas as espécies de Leishmania patogênicas estabelecer seu nicho replicative dentro de macrófagos do hospedeiro, este ensaio pode ser usado universalmente para determinações de virulência em todas as espécies de Leishmania .

Realizar infecções BMM permite a análise das interações hospedeiro-parasita no nível da célula única e, portanto, uma compreensão mais ampla de como parasitas Leishmania interagem com seu microambiente hospedeiro preferencial, os PVs dos macrófagos. Ensaios de infecção de macrófagos têm sido utilizados com sucesso por vários grupos de^{16,17,18,19,20,21,22} para explorar funções dos macrófagos do hospedeiro e Leishmania genes específicos e sua potencial participação em complexa interação que caracteriza a infecção intracelular. Infecções de BMM permitem a quantificação do crescimento do parasita como uma leitura do impacto dos fatores do hospedeiro que influenciam a sobrevivência intracelular, tais como a produção de óxido nítrico de microbicidas, geração de espécies reativas de oxigênio e outras condições adversas encontrado no interior do lisossomo, como PVs²³. Ensaios de infecção de macrófagos também têm sido utilizados para identificar pistas de drogas antileishmaniótica potencial para o desenvolvimento de terapêuticas^13,24.

A natureza em vitro de infecções BMM fornece várias vantagens sobre outros métodos para avaliar a virulência de Leishmania . No entanto, vários estudos anteriores examinar mecanismos de sobrevivência do parasita intracelular ao longo do tempo não quantificar a infecção como uma taxa^20,21,24. Além disso, muitos estudos focados nos seguintes infecções na vivo ao longo do tempo fizeram medindo o tamanho da lesão cutânea e outras sintomas fisiológicos apenas indiretamente relacionados ao parasita replicação^{25,26 , 27}. infecção in vivo é uma abordagem rigorosa para avaliar a virulência do parasita, mas medições de tamanho de lesão baseadas no Whitney inchaço sozinho são muitas vezes inadequadas, como eles refletem a resposta inflamatória nos tecidos infectados e não o número absoluto de parasitas. Por esta razão, o desenvolvimento de lesão de Whitney ensaios têm de ser seguidos pela quantificação da carga parasita em tecidos infectados, um procedimento que requer diluição limitante longa ensaios²⁸. Além disso, estudos em vivo muitas vezes envolvem sacrificar vários animais em pontos diferentes na hora de extrair os tecidos de interesse^{6,8,9,10, 11 , 13}. em contraste, um grande número de BMMs pode ser obtido de um animal, e estas células podem ser revestidas em condições que permitam a avaliação de infecção em vários pontos no tempo. Além disso, comparado com estudos em vivo , realizando em vitro infecções BMM permite maior controle sobre as condições experimentais. Quantificar os macrófagos para ser contagiado como os parasitas se permite um controle preciso da multiplicidade de infecção (MOI) e das condições de cultura. Bom controle sobre esses fatores pode ser chave na identificação de características de vias celulares discretas e na compreensão do seu impacto sobre o curso da infecção.

Dadas essas vantagens, é um pouco surpreendente que muito poucos grupos estudando a virulência de Leishmania até agora tomaram vantagem cheia de avaliação quantitativa de replicação intracelular em macrófagos. Neste artigo, discutimos as armadilhas comuns que podem estar prejudicando a utilização mais ampla deste teste e fornecer um protocolo passo a passo para facilitar a sua correcta aplicação. Considerando sua precisão e versatilidade, o ensaio de infecção BMM que descrevemos aqui pode não apenas ser utilizado para explorar interações patógeno-hospedeiro, influenciando a virulência de Leishmania , mas também para estudar outros microorganismos que replicam dentro os macrófagos²⁹. Importante, este ensaio também pode ser desenvolvido como um método de triagem pré-clínica rápida e econômica para o desenvolvimento de drogas antileishmaniótica.