Kwantificering van intracellulaire groei binnen macrofagen is een snel en betrouwbare methode voor de beoordeling van de virulentie van Leishmania parasieten
Summary
Alle pathogene Leishmania soorten zich bevinden en repliceren in macrofagen van hun gewervelde gastheren. Hier presenteren we een protocol om te infecteren lymfkliertest beenmerg-afgeleide macrofagen in cultuur met Leishmania, gevolgd door precieze kwantificering van intracellulaire groei kinetiek. Deze methode is handig voor het bestuderen van de afzonderlijke factoren beïnvloeden host-pathogen interactions en Leishmania virulentie.
Abstract
De levenscyclus van Leishmania, de verwekker van leishmaniasis, afwisselend promastigote en amastigoot fasen binnen de insecten en gewervelde gastheren, respectievelijk. Terwijl pathogene symptomen van leishmaniasis sterk, van goedaardige cutane letsels aan zeer dodelijke viscerale ziekte naar gelang van de infectieuze soorten, vormen variëren kunnen alle Leishmania soorten zich bevinden binnen de gastheer macrofagen in de gewervelde fase van hun levenscyclus. Leishmania infectiviteit is dus direct gerelateerd aan haar vermogen om vallen, overleven en repliceren binnen parasitophorous vacuolen (PVs) in macrofagen. Dus fungeert beoordelen of de parasiet de bekwaamheid om te repliceren intracellulair als een betrouwbare methode voor het bepalen van de virulentie. Bestuderen van leishmaniasis ontwikkelen met behulp van diermodellen is tijdrovend, vervelend en vaak moeilijk, met name met de pathogenically belangrijk viscerale vormen. Hier beschrijven we een methodologie om de intracellulaire ontwikkeling van Leishmania in beenmerg-afgeleide macrofagen (BMMs) volgen. Intracellulaire parasiet aantallen zijn vastgesteld op 24u tijdstippen gedurende 72-96 uur na infectie. Deze methode zorgt voor een betrouwbare bepaling van de effecten van verschillende genetische factoren op Leishmania virulentie. Als voorbeeld, laten we zien hoe een één allel schrapping van de Leishmania mitochondriale ijzer Transporter gen (LMIT1) belemmert het vermogen van de Leishmania amazonensis gemuteerde stam LMIT1/ΔLmit1 om te groeien binnen de BMMs, Als gevolg van een drastische vermindering in virulentie in vergelijking met wild-type. Deze test maakt ook nauwkeurige controle van de proefomstandigheden, die individueel kan worden gemanipuleerd om het analyseren van de invloed van verschillende factoren (voedingsstoffen, reactieve zuurstof soorten, enz.) op de host-pathogen interactions. Daarom bieden de juiste uitvoering en kwantificering van BMM infectie studies een niet-invasieve, snel, voordelig, veilig en betrouwbaar alternatief voor conventionele diermodel studies.
Introduction
Leishmaniasis verwijst naar een breed spectrum van ziekten bij de mens veroorzaakt door eencellige parasiet soorten van het geslacht Leishmania. Ongeveer 12 miljoen mensen zijn momenteel geïnfecteerd met Leishmania wereldwijd en meer dan 350 miljoen worden bedreigd. De pathologie ziekte hangt af van de soort Leishmania en gastheer factoren en symptomen variëren van onschuldige zelfhelend letsels van de huid tot dodelijke visceralizing vormen. Indien onbehandeld, viscerale leishmaniasis dodelijk is, ranking pas na malaria als de dodelijkste ziekten bij de mens veroorzaakt door infectie met een eencellige parasiet1. Ondanks de brede verschillen in ziekte pathologie en symptomen hebben alle Leishmania soorten een afwisselend promastigote en amastigoot fasen binnen insecten en gewervelde gastheren, respectievelijk digenic-levenscyclus. Binnenkant gewervelde dieren, Leishmania target host macrofagen voor invasie en de vorming van parasitophorous vacuolen (PVs), zure compartimenten met eigenschappen van de phagolysosomes waar de formulieren zeer virulente amastigoot repliceren veroorzaken. Amastigotes aanhouden in gastheer weefsel gedurende chronische infecties en doorsturen naar niet-geïnfecteerde zandvliegjes, kunnen worden doorgegeven als voltooiing van de cyclus van de transmissie. Daarom, in het kader van de ontwikkeling van ziekten bij de mens, amastigotes zijn de belangrijkste Leishmania lifecycle vorm2. Onderzoeken hoe amastigotes repliceren binnen macrofaag PVs is van cruciaal belang voor het begrip Leishmania virulentie3,4,5,6,7 en voor de ontwikkeling van nieuwe werkzame therapieën.
Hier beschrijven we een methode regelmatig gebruikt door ons laboratorium Leishmania infectie en replicatie in beenmerg-afgeleide macrofagen (BMMs), waarbij kwantitatieve beoordeling van het aantal intracellulaire Leishmania na verloop van tijd te studeren. Het proces bestaat uit het verzamelen van monocyten van muis beenmerg en differentiatie macrofagen in cultuur, in vitro besmetting met infectieuze formulieren (metacyclische promastigoten of amastigotes) van Leishmania en kwantificering van de aantal intracellulaire parasieten op elk interval van 24 uur gedurende een periode van 72-96 uur na infectie. Deze test is gebruikt in ons laboratorium om te bepalen van het effect van verscheidene milieufactoren en parasiet genen, met inbegrip van identificatie van de kritische rol van ijzer bij de bevordering van L. amazonensis virulentie verder werd gevalideerd door de struikrover laesie ontwikkelingsstudies in muizen6,8,9,10,11,12,13,14,15 . Aangezien alle pathogene Leishmania soorten hun Dr. niche binnen host macrofagen stellen, kan deze test universeel worden gebruikt voor de analyse van de virulentie in alle Leishmania soorten.
Uitvoeren van BMM infecties kan analyse van gastheer-parasiet interacties op het niveau van eencellige, en dus een uitgebreider begrip van de wisselwerking tussen Leishmania parasieten en hun voorkeur host-communicatie, de PVs van macrofagen. Macrophage infectie testen zijn met succes gebruikt door meerdere groepen16,17,18,19,20,21,22 te verkennen functies van zowel de host macrofaag Leishmania specifieke genen en hun mogelijke betrokkenheid bij de complexe wisselwerking die kenmerkend intracellulaire infectie. BMM infecties toestaan kwantificering van de groei van de parasiet als een uitlezing van de invloed van gastheer factoren die van invloed zijn intracellulair overleven, zoals microbicidal stikstofmonoxide productie, generatie van reactieve zuurstof soorten en andere ongunstige omstandigheden opgetreden binnen het lysosoom-achtige PVs23. Macrophage infectie testen hebben ook gebruikt ter identificatie van potentiële anti-Leishmania drug leads voor therapeutische ontwikkeling13,24.
De in vitro -aard van de BMM infecties biedt diverse voordelen ten opzichte van andere methoden voor het beoordelen van Leishmania virulentie. Verscheidene vorige studies onderzoeken mechanismen van intracellulaire parasiet overleven na verloop van tijd heeft echter niet kwantificeren infectie als een tarief20,21,24. Bovendien, vele studies gericht op de volgende in vivo infecties na verloop van tijd gedaan door het meten van de grootte van de cutane laesie en andere fysiologische symptomen die slechts indirect gerelateerd zijn aan de parasiet replicatie25,26 , 27. in vivo infectie is een strenge aanpak om te beoordelen van de virulentie van de parasiet, maar laesie grootte metingen gebaseerd op struikrover alleen zwelling zijn vaak ontoereikend, omdat ze de inflammatoire respons in geïnfecteerde weefsels weerspiegelen en niet de absolute aantal parasieten. Om deze reden, struikrover laesie ontwikkeling testen moeten worden gevolgd door de kwantificering van de parasiet belasting in geïnfecteerde weefsels, testen een procedure waarvoor langdurige beperkende verdunning28. Daarnaast betrekken in vivo studies vaak offeren meerdere dieren op verschillende punten in de tijd om uit te pakken van weefsels van belang6,8,9,10, 11 , 13. daarentegen grote aantallen BMMs van slechts één dier kan worden verkregen, en deze cellen kunnen verguld worden onder voorwaarden die het mogelijk maken van beoordeling van infectie op verschillende momenten in de tijd. Voorts staat ten opzichte van in vivo studies, uitvoeren van in vitro BMM infecties meer controle over de proefomstandigheden. Kwantificeren van de macrofagen besmet samen met de parasieten zich maakt nauwkeurige controle van de veelheid van infectie (MOI) en kweekomstandigheden. Fijne controle over deze factoren kunnen zijn belangrijk bij het identificeren van de kenmerken van discrete cellulaire routes en in het begrip van hun effect op het verloop van de infectie.
Gezien deze voordelen, is het enigszins verrassend dat zeer weinig groepen bestuderen van Leishmania virulentie volledig voordeel van de kwantitatieve beoordeling van intracellulaire replicatie tot nu toe hebben genomen in macrofagen. In dit artikel bespreken we gemeenschappelijke valkuilen die kunnen worden belemmert het uitgebreider gebruik van deze bepaling, en een stapsgewijze protocol om de juiste uitvoering te vergemakkelijken. Gezien haar precisie en veelzijdigheid, de BMM infectie assay we hier beschrijven kan niet alleen worden gebruikt om te verkennen van de gastheer-pathogeen interacties Leishmania virulentie te beïnvloeden, maar ook om te studeren van andere micro-organismen die repliceren binnen macrofagen29. Nog belangrijker is, kan deze bepaling ook worden ontwikkeld als een snelle en voordelige preklinische screeningsmethode voor anti-Leishmania Geneesmiddelenontwikkeling.
Protocol
Representative Results
Discussion
De kwantitatieve gegevens geproduceerd door de BMM infectie assay hierboven beschreven, kunnen onderzoekers te verkrijgen van de tarieven van de infectie en een betrouwbare bepaling van de veranderingen in virulentie eigenschappen in een relatief korte periode (maximaal 2 weken, in vergelijking met de 2 maanden vereist voor in vivo experimenten). Deze methode is gebaseerd op de DNA-specifieke kleurstof DAPI, die specifiek vlekken macrophage en parasiet kernen, en maakt snelle identificatie en kwantificering van …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health subsidie RO1 AI067979 NWA.
YK is ontvanger van undergraduate fellowship van de Howard Hughes Medical Institute/Universiteit van Maryland College Park.
Materials
| 6 well cell culture plate | Cellstar | 657160 | |
| Adenine | Acros Organics | AC147440250 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 μL) | Fisherbrand | 02-707-404 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 μL) | Fisherbrand | 02-707-430 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 μL) | Fisherbrand | 02-707-432 | |
| Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10 | Aspen Surgical | 371110 | |
| BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309604 | |
| BD Precisionglide Needle, 25G | Becton Dickinson (BD) | 305124 | |
| Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm | Cellstar | 627 160 | |
| Cell Culture Flask | Cellstar | 660175 | |
| Cover Glasses: 12 mm circles | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| D-Biotin | J.T. Baker | C272-00 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish | Corning | 351029 | |
| Fetal Bovine Serum | Seradigm | 1500-500 | |
| Ficoll400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | E200 | |
| Goat anti-mouse IgG Texas red | Invitrogen | T-862 | |
| Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Hemin | Tokyo Chemical Industry Co. LTD | H0008 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Isoton II Diluent | Beckman Coulter | 8546719 | |
| L-Glutamine | Gemini | 400-106 | |
| Medium 199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Na pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 43368 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini | 400-109 | |
| Phosphate Buffered Saline (-/-) | ThermoFisher | 14200166 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL | Cellstar | 188 271 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL | Cellstar | 227 261 | |
| ProLong Gold antifade reagent | ThermoFisher | P36930 | |
| Rat anti-mouse Lamp-1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4B | |
| Recombinant Human M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| Reichert Bright-Line Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Triton X-100 Surfactant | Millipore Sigma | TX1568-1 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Delicate Scissors, 4 1/2" | VWR | 82027-582 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip | VWR | 82027-386 | |
| Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
| Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold | Beckman Coulter | 6605699 |
References
- WHO. Control of the leishmaniases. World Health Organ Tech Rep Ser. (949), (2010).
- Naderer, T., McConville, M. J. Intracellular growth and pathogenesis of Leishmania parasites. Essays Biochem. 51, 81-95 (2011).
- Rosenzweig, D., et al. Retooling Leishmania metabolism: from sand fly gut to human macrophage. FASEB J. 22 (2), 590-602 (2008).
- Lahav, T., et al. Multiple levels of gene regulation mediate differentiation of the intracellular pathogen Leishmania. The FASEB Journal. 25 (2), 515-525 (2011).
- Saunders, E. C., et al. Induction of a stringent metabolic response in intracellular stages of Leishmania mexicana leads to increased dependence on mitochondrial metabolism. PLoS Pathog. 10 (1), e1003888 (2014).
- Mittra, B., et al. Iron uptake controls the generation of Leishmania infective forms through regulation of ROS levels. J Exp Med. 210 (2), 401-416 (2013).
- Kloehn, J., et al. Using metabolomics to dissect host-parasite interactions. Curr Opin Microbiol. 32, 59-65 (2016).
- Huynh, C., Sacks, D. L., Andrews, N. W. A Leishmania amazonensis ZIP family iron transporter is essential for parasite replication within macrophage phagolysosomes. J Exp Med. 203 (10), 2363-2375 (2006).
- Flannery, A. R., Huynh, C., Mittra, B., Mortara, R. A., Andrews, N. W. LFR1 Ferric Iron Reductase of Leishmania amazonensis Is Essential for the Generation of Infective Parasite Forms. J Biol Chem. 286 (26), 23266-23279 (2011).
- Miguel, D. C., Flannery, A. R., Mittra, B., Andrews, N. W. Heme uptake mediated by LHR1 is essential for Leishmania amazonensis virulence. Infect Immun. 81 (10), 3620-3626 (2013).
- Cortez, M., et al. Leishmania Promotes Its Own Virulence by Inducing Expression of the Host Immune Inhibitory Ligand CD200. Cell Host Microbe. 9 (6), 463-471 (2011).
- Mittra, B., Andrews, N. W. IRONy OF FATE: role of iron-mediated ROS in Leishmania differentiation. Trends Parasitol. 29 (10), 489-496 (2013).
- Mittra, B., et al. A Trypanosomatid Iron Transporter that Regulates Mitochondrial Function Is Required for Leishmania amazonensis Virulence. PLoS Pathog. 12 (1), e1005340 (2016).
- Ben-Othman, R., et al. Leishmania-mediated inhibition of iron export promotes parasite replication in macrophages. PLoS Pathog. 10 (1), e1003901 (2014).
- Renberg, R. L., et al. The Heme Transport Capacity of LHR1 Determines the Extent of Virulence in Leishmania amazonensis. PLoS Negl Trop Dis. 9 (5), e0003804 (2015).
- McConville, M. J. Metabolic Crosstalk between Leishmania and the Macrophage Host. Trends Parasitol. 32 (9), 666-668 (2016).
- Carrera, L., et al. Leishmania promastigotes selectively inhibit interleukin 12 induction in bone marrow-derived macrophages from susceptible and resistant mice. J Exp Med. 183 (2), 515-526 (1996).
- Hsiao, C. H., et al. The effects of macrophage source on the mechanism of phagocytosis and intracellular survival of Leishmania. Microbes Infect. 13 (12-13), 1033-1044 (2011).
- Murray, A. S., Lynn, M. A., McMaster, W. R. The Leishmania mexicana A600 genes are functionally required for amastigote replication. Mol Biochem Parasitol. 172 (2), 80-89 (2010).
- Farias Luz, N., et al. RIPK1 and PGAM5 Control Leishmania Replication through Distinct Mechanisms. J Immunol. 196 (12), 5056-5063 (2016).
- Franco, L. H., et al. Autophagy downstream of endosomal Toll-like receptor signaling in macrophages is a key mechanism for resistance to Leishmania major infection. J Biol Chem. 292 (32), 13087-13096 (2017).
- da Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Beverley, S. M., Floeter-Winter, L. M. Leishmania amazonensis arginase compartmentalization in the glycosome is important for parasite infectivity. PLoS One. 7 (3), e34022 (2012).
- Carneiro, P. P., et al. The Role of Nitric Oxide and Reactive Oxygen Species in the Killing of Leishmania braziliensis by Monocytes from Patients with Cutaneous Leishmaniasis. PLoS One. 11 (2), e0148084 (2016).
- Siqueira-Neto, J. L., et al. An image-based high-content screening assay for compounds targeting intracellular Leishmania donovani amastigotes in human macrophages. PLoS Negl Trop Dis. 6 (6), e1671 (2012).
- Pastor, J., et al. Combinations of ascaridole, carvacrol, and caryophyllene oxide against Leishmania. Acta Trop. 145, 31-38 (2015).
- Giarola, N. L., et al. Leishmania amazonensis: Increase in ecto-ATPase activity and parasite burden of vinblastine-resistant protozoa. Exp Parasitol. 146, 25-33 (2014).
- Sacks, D. L., Melby, P. C. Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis. Curr Protoc Immunol. , 12 (2001).
- Tabbara, K. S., et al. Conditions influencing the efficacy of vaccination with live organisms against Leishmania major infection. Infect Immun. 73 (8), 4714-4722 (2005).
- Price, J. V., Vance, R. E. The macrophage paradox. Immunity. 41 (5), 685-693 (2014).
- Huynh, C., Andrews, N. W. Iron acquisition within host cells and the pathogenicity of Leishmania. Cell Microbiol. 10 (2), 293-300 (2008).
- Blackwell, J. M., et al. SLC11A1 (formerly NRAMP1) and disease resistance. Cell Microbiol. 3 (12), 773-784 (2001).
- Pinto-da-Silva, L. H., et al. The 3A1-La monoclonal antibody reveals key features of Leishmania (L) amazonensis metacyclic promastigotes and inhibits procyclics attachment to the sand fly midgut. Int J Parasitol. 35 (7), 757-764 (2005).
- Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Exp Parasitol. 99 (2), 97-103 (2001).
- Zilberstein, D., Shapira, M. The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites. Annu Rev Microbiol. 48, 449-470 (1994).
- Bates, P. A. Transmission of Leishmania metacyclic promastigotes by phlebotomine sand flies. Int J Parasitol. 37 (10), 1097-1106 (2007).
- Bates, P. A., Robertson, C. D., Tetley, L., Coombs, G. H. Axenic cultivation and characterization of Leishmania mexicana amastigote-like forms. Parasitology. 105 (Pt 2), 193-202 (1992).
- Frickmann, H., et al. Rapid identification of Leishmania spp. in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples by fluorescence in situ hybridization. Trop Med Int Health. 17 (9), 1117-1126 (2012).
- Seguin, O., Descoteaux, A. Leishmania, the phagosome, and host responses: The journey of a parasite. Cell Immunol. 309, 1-6 (2016).
- Wanderley, J. L., Thorpe, P. E., Barcinski, M. A., Soong, L. Phosphatidylserine exposure on the surface of Leishmania amazonensis amastigotes modulates in vivo infection and dendritic cell function. Parasite Immunol. 35 (3-4), 109-119 (2013).
- Crauwels, P., et al. Apoptotic-like Leishmania exploit the host’s autophagy machinery to reduce T-cell-mediated parasite elimination. Autophagy. 11 (2), 285-297 (2015).
- Bringmann, G., et al. A novel Leishmania major amastigote assay in 96-well format for rapid drug screening and its use for discovery and evaluation of a new class of leishmanicidal quinolinium salts. Antimicrob Agents Chemother. 57 (7), 3003-3011 (2013).
- Sacks, D. L., Brodin, T. N., Turco, S. J. Developmental modification of the lipophosphoglycan from Leishmania major promastigotes during metacyclogenesis. Mol Biochem Parasitol. 42 (2), 225-233 (1990).
- Sacks, D. L. Leishmania-sand fly interactions controlling species-specific vector competence. Cell Microbiol. 3 (4), 189-196 (2001).
- McConville, M. J., Turco, S. J., Ferguson, M. A., Sacks, D. L. Developmental modification of lipophosphoglycan during the differentiation of Leishmania major promastigotes to an infectious stage. EMBO J. 11 (10), 3593-3600 (1992).
- Sacks, D. L., Hieny, S., Sher, A. Identification of cell surface carbohydrate and antigenic changes between noninfective and infective developmental stages of Leishmania major promastigotes. J Immunol. 135 (1), 564-569 (1985).
- Yao, C., Chen, Y., Sudan, B., Donelson, J. E., Wilson, M. E. Leishmania chagasi: homogenous metacyclic promastigotes isolated by buoyant density are highly virulent in a mouse model. Exp Parasitol. 118 (1), 129-133 (2008).
- Almeida Marques-da-Silva, E., et al. Extracellular nucleotide metabolism in Leishmania: influence of adenosine in the establishment of infection. Microbes Infect. 10 (8), 850-857 (2008).
- Moreira, D., et al. Impact of continuous axenic cultivation in Leishmania infantum virulence. PLoS Negl Trop Dis. 6 (1), e1469 (2012).
- Svensjo, E., et al. Interplay between parasite cysteine proteases and the host kinin system modulates microvascular leakage and macrophage infection by promastigotes of the Leishmania donovani complex. Microbes Infect. 8 (1), 206-220 (2006).
