CARIP Seq とチップ Seq: クロマチン結合 Rna および胚性幹細胞における蛋白質 DNA 相互作用を識別する方法
Summary
ここでは、チップ Seq を実行する方法について記述して ES 細胞の CARIP-Seq、次世代シーケンシング ライブラリ準備も含めて世界的なエピゲノムとクロマチン関連 RNA を生成するマップします。
Abstract
胚性幹 (ES) 細胞の自己複製と分化は細胞外シグナルと転写因子やエピジェネティックなレギュレータ叙述遺伝子に影響を及ぼすヒストンの翻訳後修飾の組み込みネットワークによって支配されます。近くの遺伝子の発現状態。RNA は、クロマチン動態と遺伝子発現を調節する様々 な蛋白質と相互作用を示されています。クロマチン関連 RNA 法 (CARIP) を次世代シーケンサー (CARIP-Seq) 続いて、次世代シーケンス (続いてクロマチン免疫沈降中のクロマチン蛋白質に関連付けられている Rna を調査する手法ChIP-Seq) ES 細胞におけるグローバル規模でのエピジェネティックな修飾子、転写因子、ヒストン翻訳後修飾の場所をマップする強力なゲノミクス手法です。ここでは、我々 は CARIP Seq とチップ Seq、次世代シーケンス、図書館建設を含む ES 細胞におけるグローバル クロマチン関連 RNA とエピゲノムのマップを生成するを実行する方法を説明します。
Introduction
胚性幹 (ES) 細胞の運命決定は、細胞外のシグナルと転写制御因子、ヒストン修飾子、およびヒストンの尾の翻訳後修飾を含むホスト間の通信によって規制されています。これらの相互作用を容易にして 2 つの状態のいずれかにクロマチンの包装: オープンと転写活性状態にあるユークロマチンと異質染色質、コンパクトで一般に transcriptionally であります。トランスクリプション要因 DNA シーケンス固有結合親和性と遺伝子発現の制御に参加するユークロマチン領域のエピジェネティックな修飾子准。チップ Seq1, を含む次世代シーケンシング方法は ES 細胞の自己複製と多能性2,3,4 の基礎ゲノムの転写ネットワークのマッピングに尽力されています。 ,5,6。さらに、RNA immunopreciation RNA 蛋白質の相互作用の次世代シーケンス (Seq-RIP)7評価が続く中 DNA 結合タンパク質が Rna 転写イベント7,を規制すると対話することを示唆します。8,9,10,11,12、いくつかの研究は、クロマチン12、または RNA およびヒストンの修正の世界的な相互作用に関連付けられている Rna のゲノムの局在を検討しました。長い非コード Rna (lncRNAs) は、クロマチン蛋白13,14,15の活動を規制する発見されている Rna の 1 つのクラスです。たとえば、Xist は、女性哺乳類細胞におけるエピジェネティックなリプレッサー16,17の募集を通じて、1 つの X 染色体の不活性化を調節する lncRNA です。しかし、クロマチンに関連付けられている Rna の完全なスペクトルはほとんど知られてないです。ここでは、新しいプロトコル、クロマチン関連 RNA 法 (CARIP) の次世代シーケンサー (CARIP-Seq)、ライブラリの準備も含めて、ES 細胞のゲノムにクロマチン結合 Rna を識別するために続いてについて述べる次世代シーケンシング、およびヒストンの修正、転写因子やエピジェネティックな修飾子のグローバル占有をマップするチップ Seq。その他 RIP Seq 方法7とは異なり CARIP Seq には、クロマチンに関連付けられている Rna の直接同定架橋と超音波処理の手順が含まれます。一緒に、チップ Seq はゲノム蛋白質 DNA の相互作用を識別するために強力なツールをクロマチンのコンポーネントに関連付けられている Rna CARIP Seq は調査する強力な方法です。
Protocol
Representative Results
Discussion
チップ Seq はグローバル蛋白質 DNA の相互作用の場所を評価するための有用な方法 (e.g、トランスクリプション要因/ヒストン/ヒストン修飾酵素と DNA の変更) ES 細胞、新開発の CARIP Seq プロトコルは便利で。クロマチンの成分と Rna のゲノム広い連合を尋問します。チップ Seq は ES 細胞のエピジェネティックな風景や他の細胞型を評価するために使用する基本的なツールです。チップ Seq ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この仕事は、ウェイン州立大学、バーバラアンカルマノスがん研究所、国立心臓、肺、血液研究所 (1K22HL126842 01A1) B.L.K. に与えられるからの助成金によって支えられました。この作品はウェイン州立大学高パフォーマンス コンピューティング グリッド計算資源の活用 ()。CARIP Seq データ分析支援ありがとうジジ ロッグマン。
著者の貢献:
B.L.K. は、CARIP Seq 法の考案し設計チップ Seq と CARIP Seq 実験を実施し、シーケンス データを分析した原稿を起草しました。すべての著者を読むし、この原稿の最終バージョンを承認しました。
Materials
| Mouse leukemia inhibitory factor (ESGRO LIF) | EMD Millipore | 106 or 107 units | |
| GSK3β inhibitor CHIR99021 (GSK3i) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| MEK inhibitor PD0325901 (MEKi) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Invitrogen | 11965092 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Invitrogen | 10010031 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140076 | |
| EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml | EMD Millipore | ES-009-B | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | EMD Millipore | ES-006-B | |
| Glycine | Sigma | G7126-500G | 1.25 M stock conentration in water |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-500ML | |
| TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X | Quality Biological | 351-011-131 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) solution | Sigma | 93482-250ML-F | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution (20%) | Quality Biological | A611-0837-10 | |
| Q125 sonifier | Qsonica | 4422 | |
| Triton X-100 solution | Sigma | 93443-100ML | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10004D | |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein A/Protein G and Magnet Starter Pack | Invitrogen | 10015D | |
| Lithium chloride | Sigma | L4408 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Purification Kit (for mRNA purification from total RNA preps) | Invitrogen | 61006 | |
| SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11917010 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER81050 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | NEB | M0212L | |
| dATP (10 mM) | Invitrogen | 18252015 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen | 10488085 | |
| E-gel EX agarose gels, 2% | Invitrogen | G402002 | |
| Phusion high-fidelity 2X master mix with HF buffer | Thermo Fisher | F531LPM | |
| ChIPAb+ Trimethyl-Histone H3 (Lys4) – ChIP Validated Antibody | EMD Millipore | 17-614 | |
| Anti-Histone H3 (di methyl K4) antibody [Y47] – ChIP Grade (ab32356) | Abcam | ab32356 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-well) | Fisher | 720083 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (10cm) | Fisher | 08772E | |
| Bioruptor pico | Diagenode | B01010001 | |
| Qubit Flurometer 2.0 | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | |
| Anti-Histone H4 (tri methyl K20) antibody – ChIP Grade (ab9053) | Abcam | ab9053 | |
| Labquake rotator | Thermo Fisher | 400110Q | |
| Illumina HiSeq platform | Illumina | ||
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2238 |
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