Seq كاريب ورقاقة Seq: أساليب لتحديد الكشف المرتبطة الكروماتين وتفاعلات البروتين-الحمض النووي في الخلايا الجذعية الجنينية
Summary
هنا، يمكننا وصف أساليب أداء Seq رقاقة وخرائط كاريب-Seq، بما في ذلك إعداد المكتبة لتسلسل الجيل القادم، لتوليد ابيجينوميك العالمية، والجيش الملكي النيبالي المرتبطة الكروماتين في دإط الخلايا.
Abstract
الخلايا الجذعية الجنينية (ES) الذاتي تجديد والتمايز محكوم بإشارات خارجية والشبكات المضمنة المنظمين جينية، عوامل النسخ والترجمة بعد إدخال تعديلات على هيستونيس التي كومبيناتوريالي تؤثر الجينات الدولة تعبير الجينات القريبة. كما تبين أيضا الجيش الملكي النيبالي للتفاعل مع البروتينات المختلفة لتنظيم ديناميات الكروماتين والتعبير الجيني. إيمونوبريسيبيتيشن رنا المرتبطة الكروماتين (كاريب) تليها الجيل التالي التسلسل (كاريب-Seq) طريقة جديدة لمسح الكشف المرتبطة بالبروتينات الكروماتين، بينما الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن تليها (تسلسل الجيل المقبل تشيبسيق) وأسلوب الجينوميات قوية خريطة موقع تعديل بوستترانسلاشونال هيستونيس، وعوامل النسخ والمعدلات جينية على نطاق عالمي في دإط الخلايا. هنا، يمكننا وصف أساليب لأداء Seq كاريب ورقاقة-Seq، بما في ذلك بناء مكتبة لتسلسل الجيل القادم، لتوليد الحمض النووي الريبي العالمية المرتبطة الكروماتين وخرائط ابيجينوميك في خلايا ES.
Introduction
وينظم الاتصال بين إشارات خارج الخلية ومجموعة من النسخي المنظمين، بما في ذلك معدلات هستون، وتعديل الترجمة بعد انتهاء ذيول هيستون قرارات مصير الخلايا الجذعية الجنينية (ES). هذه التفاعلات تيسير الوصول الكروماتين والتعبئة والتغليف من الكروماتين في واحدة من دولتين: يوتشروماتين، ومفتوحة ونشطة ترانسكريبتيونالي، وهيتيروتشروماتين، وصغير وعموما ترانسكريبتيونالي الخاملة. عوامل النسخ مع الانتماءات الملزمة الخاصة بتسلسل الحمض النووي ومعاون المعدلات جينية مع المناطق يوتشروماتيك للمشاركة في التحكم في التعبير الجيني. أساليب تسلسل الجيل القادم، بما فيها رقاقة Seq1، قد ساعدت في رسم خرائط الجينوم على نطاق شبكات النسخي التي أساسية بالنسبة لوفاق الخلية التجديد الذاتي وبلوريبوتينسي2،3،4 ،،من56. وعلاوة على ذلك، بينما إيمونوبريسييشن الحمض النووي الريبي تليها الجيل التالي التسلسل (RIP-Seq)7 تقييمات لتفاعلات البروتين الحمض النووي الريبي تشير إلى أن الحمض النووي ملزم البروتينات تتفاعل مع الكشف لتنظيم أحداث النسخي7، 8 , 9 , 10 , 11 , 12، حققت بضعة دراسات التعريب على نطاق الجينوم للكشف المرتبطة الكروماتين12، أو التفاعلات العالمية بين التعديلات الجيش الملكي النيبالي وهيستون. الكشف منذ فترة طويلة غير الترميز (لنكرناس) هي فئة واحدة من الكشف التي تم العثور عليها لتنظيم نشاط البروتينات المرتبطة الكروماتين13،،من1415. على سبيل المثال، هو زيست لنكرنا الذي ينظم، في خلايا الثدييات الإناث، المنظمة كروموسوم إكس واحد، عن طريق تعيين16،ريبريسورس جينية17. الطيف الكامل من الكشف المرتبطة بلونين غير معروفة إلى حد كبير. هنا، يمكننا وصف بروتوكول رواية، إيمونوبريسيبيتيشن الحمض النووي الريبي المرتبطة الكروماتين (كاريب) تليها الجيل التالي التسلسل (كاريب-Seq)، لتحديد الكشف المرتبطة الكروماتين على نطاق الجينوم في دإط الخلايا، بما في ذلك إعداد المكتبة تسلسل الجيل المقبل، ورقاقة-Seq خريطة شغل عالمي هستون التعديلات وعوامل النسخ والمعدلات جينية. خلافا لسائر أساليب Seq التمزق7، يتضمن كاريب-تسلسل الخطوات crosslinking وسونيكيشن، والتي تسمح للتعرف مباشرة على الكشف المرتبطة بلونين. معا، Seq رقاقة أداة قوية لتحديد تفاعلات البروتين على نطاق الجينوم الحمض النووي، بينما كاريب Seq وسيلة قوية لمسح الكشف المرتبطة بمكونات الكروماتين.
Protocol
Representative Results
Discussion
رقاقة-Seq طريقة مفيدة لتقييم موقع تفاعلات البروتين الحمض النووي العالمي (مثلاً.، عوامل النسخ/هستون تعديل التعديلات الإنزيمات/هيستون والحمض النووي) في دإط الخلايا، بينما البروتوكول Seq كاريب المطورة حديثا مفيد في استجواب الرابطة على نطاق الجينوم للكشف مع مكونات الكروماتين. رقاقة-Seq هو أ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أيد هذا العمل وأين الدولة الجامعة، كارمانوس معهد السرطان، منحة من الوطني للقلب والرئة والدم معهد (1K22HL126842-01A1) منحت إلى B.L.K. يستخدم هذا العمل “وأين الدولة جامعة عالية الأداء الحوسبة الشبكة” للموارد الحسابية (). ونحن نشكر كوروب جيجي للمساعدة في تحليل البيانات كاريب Seq.
مساهمات المؤلفين:
B.L.K. تصور طريقة Seq كاريب وصممت ونفذت تجارب Seq رقاقة و Seq كاريب وتحليل البيانات التسلسل وصياغة المخطوط. جميع المؤلفين قد قرأت ووافقت الصيغة النهائية لهذه المخطوطة.
Materials
| Mouse leukemia inhibitory factor (ESGRO LIF) | EMD Millipore | 106 or 107 units | |
| GSK3β inhibitor CHIR99021 (GSK3i) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| MEK inhibitor PD0325901 (MEKi) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Invitrogen | 11965092 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Invitrogen | 10010031 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140076 | |
| EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml | EMD Millipore | ES-009-B | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | EMD Millipore | ES-006-B | |
| Glycine | Sigma | G7126-500G | 1.25 M stock conentration in water |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-500ML | |
| TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X | Quality Biological | 351-011-131 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) solution | Sigma | 93482-250ML-F | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution (20%) | Quality Biological | A611-0837-10 | |
| Q125 sonifier | Qsonica | 4422 | |
| Triton X-100 solution | Sigma | 93443-100ML | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10004D | |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein A/Protein G and Magnet Starter Pack | Invitrogen | 10015D | |
| Lithium chloride | Sigma | L4408 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Purification Kit (for mRNA purification from total RNA preps) | Invitrogen | 61006 | |
| SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11917010 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER81050 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | NEB | M0212L | |
| dATP (10 mM) | Invitrogen | 18252015 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen | 10488085 | |
| E-gel EX agarose gels, 2% | Invitrogen | G402002 | |
| Phusion high-fidelity 2X master mix with HF buffer | Thermo Fisher | F531LPM | |
| ChIPAb+ Trimethyl-Histone H3 (Lys4) – ChIP Validated Antibody | EMD Millipore | 17-614 | |
| Anti-Histone H3 (di methyl K4) antibody [Y47] – ChIP Grade (ab32356) | Abcam | ab32356 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-well) | Fisher | 720083 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (10cm) | Fisher | 08772E | |
| Bioruptor pico | Diagenode | B01010001 | |
| Qubit Flurometer 2.0 | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | |
| Anti-Histone H4 (tri methyl K20) antibody – ChIP Grade (ab9053) | Abcam | ab9053 | |
| Labquake rotator | Thermo Fisher | 400110Q | |
| Illumina HiSeq platform | Illumina | ||
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2238 |
References
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
- Boyer, L. A., et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell. 122 (6), 947-956 (2005).
- Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
- Kidder, B. L., Hu, G., Yu, Z. X., Liu, C., Zhao, K. Extended self-renewal and accelerated reprogramming in the absence of Kdm5b. Mol Cell Biol. 33, 4793-4810 (2013).
- Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. KDM5B focuses H3K4 methylation near promoters and enhancers during embryonic stem cell self-renewal and differentiation. Genome Biol. 15 (2), R32 (2014).
- Zhao, J., et al. Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Hudson, W. H., Ortlund, E. A. The structure, function and evolution of proteins that bind DNA and RNA. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 749-760 (2014).
- Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. P Natl Acad Sci USA. 106 (28), 11667-11672 (2009).
- Hendrickson, D. G., Kelley, D. R., Tenen, D., Bernstein, B., Rinn, J. L. Widespread RNA binding by chromatin-associated proteins. Genome Biol. 17, 28 (2016).
- Kelley, R. L., Kuroda, M. I. Noncoding RNA genes in dosage compensation and imprinting. Cell. 103 (1), 9-12 (2000).
- Koziol, M. J., Rinn, J. L. RNA traffic control of chromatin complexes. Curr Opin Genet Dev. 20 (2), 142-148 (2010).
- Mercer, T. R., Mattick, J. S. Structure and function of long noncoding RNAs in epigenetic regulation. Nat Struct Mol Bio. 20 (3), 300-307 (2013).
- Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
- Mak, W., et al. Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos. Science. 303 (5658), 666-669 (2004).
- Garfield, A. S. Derivation of primary mouse embryonic fibroblast (PMEF) cultures. Methods Mol Biol. 633, 19-27 (2010).
- Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Zang, C., et al. A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data. Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Liu, T. Use model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) to analyze short reads generated by sequencing protein-DNA interactions in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1150, 81-95 (2014).
- Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. ChIP-Seq: technical considerations for obtaining high-quality data. Nat Immunol. 12 (10), 918-922 (2011).
- Quail, M. A., et al. A large genome center’s improvements to the Illumina sequencing system. Nat Methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
