CARIP-Seq ו שבב-Seq: שיטות לזיהוי RNAs הקשורים כרומטין והן אינטראקציות חלבון-DNA בתאי גזע עובריים
Summary
כאן, אנו מתארים שיטות לביצוע שבב-Seq ומפות CARIP-Seq, כולל ספריית לקראת הדור הבא רצפי, ליצירת epigenomic הכללית ו- RNA הקשורים כרומטין תאים ES.
Abstract
גזע עובריים (ES) תא התחדשות עצמית, בידול נשלטת על ידי אותות חיצוני ורשתות מהותי של גורמי שעתוק epigenetic regulators, שינויים פוסט-תרגום של שינויים היסטוניים combinatorially להשפיע על הגן מצב ביטוי של גנים הסמוכה. RNA הוכח גם לקיים אינטראקציה עם חלבונים שונים כדי לווסת כרומטין דינמיקה של ביטוי גנים. כרומטין-הקשורים RNA immunoprecipitation (CARIP) ואחריו הדור הבא רצפי (CARIP-Seq) היא שיטה סקר RNAs המשויך חלבוני כרומטין, בעוד immunoprecipitation כרומטין ואחריו (הדור הבא רצפי ChIP-Seq) היא טכניקה גנומיקה חזק כדי למפות את המיקום של שינוי post-translational של שינויים היסטוניים, גורמי שעתוק, מכפילי epigenetic בקנה מידה עולמי תאים ES. כאן, אנו מתארים שיטות לבצע CARIP-Seq שבב-Seq, כולל בניית ספריה עבור הדור הבא רצף, ליצירת RNA הקשורים כרומטין הכללית ומפות epigenomic ES תאים.
Introduction
החלטות גורל תאי גזע עובריים (ES) מוסדרים על ידי תקשורת בין אותות חוץ-תאית וכן שורה של גנים ברמת השעתוק-וסתים, כולל היסטון מגבילים, תרגום שלאחר שינוי של היסטון זנבות. אינטראקציות אלה להקל על נגישות כרומטין, אריזה של כרומטין לתוך אחד של שתי מדינות: euchromatin, אשר פתוח ופעיל transcriptionally, ואת הטרוכרומטין, אשר הוא קומפקטי וקל בדרך כלל transcriptionally לא פעיל. גורמי שעתוק DNA רצף ספציפי איגוד הזיקות, עמית מכפילי epigenetic עם אזורים תהיה להשתתף בשליטה על ביטוי גנים. הדור הבא רצפי שיטות, כולל צ’יפ-Seq1, היה אינסטרומנטלי מיפוי הגנום כולו רשתות תעתיק מהותי עבור ES תא התחדשות עצמית, pluripotency2,3,4 5, ,6. יתר על כן, בעוד immunopreciation RNA ואחריו הדור הבא רצף (RIP-Seq)7 ההערכות של אינטראקציות חלבון ה-RNA מציע כי ה-DNA מחייבת חלבונים אינטראקציה עם RNAs להסדיר אירועים תעתיק7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12, מחקרים מעטים חקרו לוקליזציה ברמת הגנום של RNAs המשויך כרומטין12או גלובלי האינטראקציות בין שינויים RNA והיסטון. זמן אי קידוד RNAs (lncRNAs) הם קבוצה אחת של RNAs אשר נמצאו להסדיר את הפעילות של חלבונים הקשורים כרומטין13,14,15. לדוגמה, Xist הוא lncRNA המווסת, בתאים בתרבית של נקבה, איון של כרומוזום X אחד, דרך הגיוס של epigenetic repressors16,17. אולם, מלוא הספקטרום של RNAs הקשורים עם כרומטין הוא אינו מודע לקיומם. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול הרומן, הקשורים כרומטין RNA immunoprecipitation (CARIP) ואחריו הדור הבא רצפי (CARIP-Seq), לזיהוי הקשורים כרומטין RNAs על בסיס הגנום כולו, תאים ES, כולל הכנה ספריה עבור הדור הבא רצפי, צ’יפ-Seq למפות תפוסת הכללית של שינויים היסטון, גורמי שעתוק, מכפילי epigenetic. שלא כמו שאר שיטות RIP-Seq7, CARIP-Seq כולל שלבים crosslinking ו sonication, המאפשרים זיהוי ישיר RNAs הקשורים עם כרומטין. יחד, צ’יפ-Seq הוא כלי רב עוצמה לזיהוי אינטראקציות חלבון-DNA הגנום כולו, בזמן CARIP-Seq היא שיטה חזקה סקר RNAs הקשורים רכיבים כרומטין.
Protocol
Representative Results
Discussion
שבב-Seq היא שיטה שימושית כדי להעריך את המיקום של אינטראקציות חלבון העולמי-DNA (למשל., גורמי שעתוק/שינוי שינויים אנזימים/היסטון ודנ א היסטון) תאים ES, בעוד פרוטוקול CARIP-Seq פיתח הוא שימושי חוקר את השיוך ברמת הגנום של RNAs המרכיבים כרומטין. שבב-Seq הוא כלי בסיסי המשמש כדי להעריך נופים epigenetic של תאים …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי ויין סטייט, Karmanos סרטן אוניברסיטאי, מענק מן הלאומי ללב, ריאות ודם המכון (1K22HL126842-01A1) הוענק B.L.K. עבודה זו מנוצל ויין המדינה אוניברסיטת גבוהה ביצועי מחשוב ברשת עבור משאבים חישובית (). אנו מודים ג’יג’י Kurup על סיוע עם ניתוח נתונים CARIP-Seq.
התרומות של המחברים:
B.L.K. היגו בשיטת CARIP-Seq, תוכנן ביצעו ניסויים שבב-Seq ו- CARIP-Seq, ניתח את הנתונים רצף ו ניסח את כתב היד. כל המחברים לקרוא, אישר את הגרסה הסופית של כתב היד הזה.
Materials
| Mouse leukemia inhibitory factor (ESGRO LIF) | EMD Millipore | 106 or 107 units | |
| GSK3β inhibitor CHIR99021 (GSK3i) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| MEK inhibitor PD0325901 (MEKi) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Invitrogen | 11965092 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Invitrogen | 10010031 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140076 | |
| EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml | EMD Millipore | ES-009-B | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | EMD Millipore | ES-006-B | |
| Glycine | Sigma | G7126-500G | 1.25 M stock conentration in water |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-500ML | |
| TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X | Quality Biological | 351-011-131 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) solution | Sigma | 93482-250ML-F | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution (20%) | Quality Biological | A611-0837-10 | |
| Q125 sonifier | Qsonica | 4422 | |
| Triton X-100 solution | Sigma | 93443-100ML | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10004D | |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein A/Protein G and Magnet Starter Pack | Invitrogen | 10015D | |
| Lithium chloride | Sigma | L4408 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Purification Kit (for mRNA purification from total RNA preps) | Invitrogen | 61006 | |
| SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11917010 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER81050 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | NEB | M0212L | |
| dATP (10 mM) | Invitrogen | 18252015 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen | 10488085 | |
| E-gel EX agarose gels, 2% | Invitrogen | G402002 | |
| Phusion high-fidelity 2X master mix with HF buffer | Thermo Fisher | F531LPM | |
| ChIPAb+ Trimethyl-Histone H3 (Lys4) – ChIP Validated Antibody | EMD Millipore | 17-614 | |
| Anti-Histone H3 (di methyl K4) antibody [Y47] – ChIP Grade (ab32356) | Abcam | ab32356 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-well) | Fisher | 720083 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (10cm) | Fisher | 08772E | |
| Bioruptor pico | Diagenode | B01010001 | |
| Qubit Flurometer 2.0 | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | |
| Anti-Histone H4 (tri methyl K20) antibody – ChIP Grade (ab9053) | Abcam | ab9053 | |
| Labquake rotator | Thermo Fisher | 400110Q | |
| Illumina HiSeq platform | Illumina | ||
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2238 |
References
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
- Boyer, L. A., et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell. 122 (6), 947-956 (2005).
- Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
- Kidder, B. L., Hu, G., Yu, Z. X., Liu, C., Zhao, K. Extended self-renewal and accelerated reprogramming in the absence of Kdm5b. Mol Cell Biol. 33, 4793-4810 (2013).
- Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. KDM5B focuses H3K4 methylation near promoters and enhancers during embryonic stem cell self-renewal and differentiation. Genome Biol. 15 (2), R32 (2014).
- Zhao, J., et al. Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Hudson, W. H., Ortlund, E. A. The structure, function and evolution of proteins that bind DNA and RNA. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 749-760 (2014).
- Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. P Natl Acad Sci USA. 106 (28), 11667-11672 (2009).
- Hendrickson, D. G., Kelley, D. R., Tenen, D., Bernstein, B., Rinn, J. L. Widespread RNA binding by chromatin-associated proteins. Genome Biol. 17, 28 (2016).
- Kelley, R. L., Kuroda, M. I. Noncoding RNA genes in dosage compensation and imprinting. Cell. 103 (1), 9-12 (2000).
- Koziol, M. J., Rinn, J. L. RNA traffic control of chromatin complexes. Curr Opin Genet Dev. 20 (2), 142-148 (2010).
- Mercer, T. R., Mattick, J. S. Structure and function of long noncoding RNAs in epigenetic regulation. Nat Struct Mol Bio. 20 (3), 300-307 (2013).
- Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
- Mak, W., et al. Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos. Science. 303 (5658), 666-669 (2004).
- Garfield, A. S. Derivation of primary mouse embryonic fibroblast (PMEF) cultures. Methods Mol Biol. 633, 19-27 (2010).
- Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Zang, C., et al. A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data. Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Liu, T. Use model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) to analyze short reads generated by sequencing protein-DNA interactions in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1150, 81-95 (2014).
- Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. ChIP-Seq: technical considerations for obtaining high-quality data. Nat Immunol. 12 (10), 918-922 (2011).
- Quail, M. A., et al. A large genome center’s improvements to the Illumina sequencing system. Nat Methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
