CARIP-Seq e ChIP-Seq: metodi per identificare la cromatina associata RNAs e interazioni proteina-DNA in cellule staminali embrionali
Summary
Qui, descriviamo i metodi per eseguire ChIP-Seq e CARIP-Seq, compresa la preparazione di libreria per il sequenziamento di nuova generazione, per generare globale epigenomic e cromatina-associated RNA mappe in cellule ES.
Abstract
Cellule staminali embrionali (ES) auto-rinnovamento e differenziazione è regolata dai segnali estrinseci e intrinseci reti di fattori di trascrizione, regolatori epigenetici e modificazioni post-traduzionali degli istoni che combinatoriamente influenzano il gene stato di espressione di geni vicini. RNA ha anche dimostrato di interagire con diverse proteine per regolare la dinamica della cromatina ed espressione genica. Cromatina-associated RNA immunoprecipitazione (CARIP) seguite dal sequenziamento di nuova generazione (CARIP-Seq) è un nuovo metodo di indagine RNAs associato a proteine della cromatina, mentre immunoprecipitazione della cromatina seguita da sequenziamento di nuova generazione ( ChIP-Seq) è una tecnica potente genomica per mappare la posizione di modificazione post-traduzionale di istoni, fattori di trascrizione e modificatori epigenetici su una scala globale in cellule ES. Qui, descriviamo i metodi per eseguire CARIP-Seq e ChIP-Seq, tra cui la costruzione della libreria per la sequenziazione di prossima generazione, per generare mappe epigenomic e globale della cromatina-associated RNA in cellule ES.
Introduction
Le decisioni di destino delle cellule staminali embrionali (ES) sono regolate dalla comunicazione tra segnali extracellulari e una serie di regolatori trascrizionali, inclusi i modificatori dell’istone e modifica post-traduzionali degli istoni. Queste interazioni facilitano l’accessibilità della cromatina e impacchettamento della cromatina in uno dei due stati: l’eucromatina, che è aperta e trascrizionalmente attiva, e l’eterocromatina, che è compatto e generalmente trascrizionalmente inattiva. Fattori di trascrizione con affinità di legame al DNA sequenza-specifico e modificatori epigenetici associato con regioni eucromatiche di partecipare nel controllo dell’espressione genica. Metodi di sequenziamento di nuova generazione, tra cui ChIP-Seq1, sono state strumentali nella mappatura reti trascrizionali genoma che sono fondamentali per ES cella auto-rinnovamento e pluripotenza2,3,4 ,5,6. Inoltre, mentre RNA immunopreciation generazione sequenziamento (RIP-Seq)7 valutazioni delle interazioni RNA-proteina suggeriscono che proteine che legano il DNA interagiscono con RNA per regolare gli eventi trascrizionali7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12, pochi studi hanno studiato la localizzazione di genoma di RNA associati con cromatina12o interazioni globali tra modifiche di RNA e dell’istone. RNA lunghi non codificanti (lncRNAs) è una classe di RNA che sono stati trovati per regolare l’attività di proteine della cromatina associate13,14,15. Ad esempio, Xist è un lncRNA che regola, in cellule di mammifero femminile, l’inattivazione di un cromosoma di X, attraverso il reclutamento di repressori epigenetici16,17. Tuttavia, l’intero spettro degli RNA associati con cromatina è in gran parte sconosciuto. Qui, descriviamo un protocollo di romanzo, cromatina-associated RNA immunoprecipitazione (CARIP) seguita da sequenziamento di nuova generazione (CARIP-Seq), per identificare il RNAs cromatina-collegato su una base di genoma in cellule ES, compresa la biblioteca preparazione per sequenziamento di nuova generazione e ChIP-Seq per mappare occupazione globale di modificazioni istoniche, fattori di trascrizione e modificatori epigenetici. A differenza di altri metodi di RIP-Seq7, CARIP-Seq comprende fasi di reticolazione e sonicazione, che consentono l’identificazione diretta degli RNA associati della cromatina. Insieme, ChIP-Seq è un potente strumento per identificare le interazioni proteina-DNA del genoma, mentre CARIP-Seq è un potente metodo di indagine RNAs associato a componenti della cromatina.
Protocol
Representative Results
Discussion
ChIP-Seq è un metodo utile per valutare la posizione delle interazioni proteina-DNA globale (ad es., fattori di trascrizione/istone modifica modifiche istoniche/enzimi e DNA) in cellule ES, mentre il protocollo di CARIP-Seq recente sviluppato è utile in interrogando associazione genome-wide di RNA con costituenti della cromatina. ChIP-Seq è uno strumento fondamentale che viene utilizzato per valutare epigenetici paesaggi delle celle di ES e altri tipi di cellule. La qualità del ChIP-Seq e librerie CARIP-Seq …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da Wayne State University, Karmanos Cancer Institute, una borsa di studio dal National Heart, Lung e Istituto del sangue (1K22HL126842-01A1) assegnato a B.L.K. Questo lavoro utilizzata la Wayne State University alta Performance Computing Grid per risorse computazionali (). Ringraziamo Jiji Kurup per assistenza con l’analisi dei dati CARIP-Seq.
CONTRIBUTI DEGLI AUTORI:
B.L.K. concepì il metodo CARIP-Seq, progettato e realizzazione degli esperimenti di ChIP-Seq e CARIP-Seq, analizzati i dati di sequenziamento e redatto il manoscritto. Tutti gli autori hanno letto e approvato la versione finale di questo manoscritto.
Materials
| Mouse leukemia inhibitory factor (ESGRO LIF) | EMD Millipore | 106 or 107 units | |
| GSK3β inhibitor CHIR99021 (GSK3i) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| MEK inhibitor PD0325901 (MEKi) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Invitrogen | 11965092 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Invitrogen | 10010031 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140076 | |
| EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml | EMD Millipore | ES-009-B | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | EMD Millipore | ES-006-B | |
| Glycine | Sigma | G7126-500G | 1.25 M stock conentration in water |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-500ML | |
| TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X | Quality Biological | 351-011-131 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) solution | Sigma | 93482-250ML-F | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution (20%) | Quality Biological | A611-0837-10 | |
| Q125 sonifier | Qsonica | 4422 | |
| Triton X-100 solution | Sigma | 93443-100ML | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10004D | |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein A/Protein G and Magnet Starter Pack | Invitrogen | 10015D | |
| Lithium chloride | Sigma | L4408 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Purification Kit (for mRNA purification from total RNA preps) | Invitrogen | 61006 | |
| SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11917010 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER81050 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | NEB | M0212L | |
| dATP (10 mM) | Invitrogen | 18252015 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen | 10488085 | |
| E-gel EX agarose gels, 2% | Invitrogen | G402002 | |
| Phusion high-fidelity 2X master mix with HF buffer | Thermo Fisher | F531LPM | |
| ChIPAb+ Trimethyl-Histone H3 (Lys4) – ChIP Validated Antibody | EMD Millipore | 17-614 | |
| Anti-Histone H3 (di methyl K4) antibody [Y47] – ChIP Grade (ab32356) | Abcam | ab32356 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-well) | Fisher | 720083 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (10cm) | Fisher | 08772E | |
| Bioruptor pico | Diagenode | B01010001 | |
| Qubit Flurometer 2.0 | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | |
| Anti-Histone H4 (tri methyl K20) antibody – ChIP Grade (ab9053) | Abcam | ab9053 | |
| Labquake rotator | Thermo Fisher | 400110Q | |
| Illumina HiSeq platform | Illumina | ||
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2238 |
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