Protein toplama Maya hücresel oksidatif stres üzerinde etkisi değerlendirilmesi
Summary
Protein toplama hücresel oksidatif stres ortaya çıkarır. Bu iletişim kuralı amyloidogenic proteinlerin hücre içi Birleşik ve onlarla akış sitometresi kullanarak ilişkili oksidatif stres izlemek için bir yöntem açıklanır. Yaklaşım β-amiloid peptid çözünür ve toplama eğilimli türevleri davranışını incelemek için kullanılır.
Abstract
Protein misfolding ve toplama amiloid biçimler içine başlangıçlı ve ilerleme çeşitli nörodejeneratif hastalıklar ile ilgili olduğu. Ancak, hala çok az bilgi var hakkında nasıl çözünmez protein toplamları onların toksik etkileri içinde vivouygulamayın. Basit prokaryotik ve ökaryotik canlılar, bakteri ve Maya, gibi önemli ölçüde mevcut anlayışımız mekanizmaları hücre içi amiloid dil oluşumu, toplamları yayma ve toksisite arkasında katkıda bulunmuştur. Bu protokol için maya kullanımı protein toplamları oluşumu ve hücresel oksidatif stres üzerindeki etkileri arasındaki ilişkiyi incelemek için bir model olarak tanımlanıyor. Yöntem bir amyloidogenic protein çözünür/toplanan hücre içi durumunu algılama akış sitometresi (FC) kullanarak kendi ifadeden kaynaklanan hücresel oksidatif hasar miktar ile birleştirir. Bu basit, hızlı ve nicel yaklaşımdır. Çalışma tekniği β-amiloid peptid türevleri ile onların anılan sıraya göre iç Toplama eğilimlerini büyük bir set neden hücresel oksidatif stres birleştiriliyor tarafından gösterilmektedir.
Introduction
Proteostasis hücre fitness ve yaşlanma süreçlerinin temel bir belirleyici olduğunu. Hücrelerde, protein homeostazı sofistike protein kalite kontrol doğru misfolded protein conformers chaperones ve/veya onların hedeflenen proteolizis tarafından birkaç iyi korunmuş mekanizmalarıyla1 refolding emin olmak için ağlar amaçlayan tarafından yapılmaktadır ,2,3,4,5. Çok sayıda çalışmalar başlangıçlı ve geniş bir insan hastalıkları ve proteostasis, protein misfolding ve toplama için önde gelen başarısızlık arasındaki bağlantı için destek sağlar. Örneğin, protein mevduat varlığı çok nörodejeneratif hastalıkları, Alzheimer, Parkinson, gibi ve Huntington hastalıkları6,7,8patolojik damgasını olarak kabul edilir, prionogenic hastalıklar ve sigara dejeneratif amyloidoses9. Toplama tepki erken oligomeric ve protofibrillar derlemelerde diğer proteinler ile anormal etkileşim içinde kalabalık hücresel ortamı10kurulması ana elicitors, sitotoksisite, çoğu sürülmüştür. Buna ek olarak, protein kapanımlar (PI) onların toksik etkisi11,12yayılıyor hücreler arasında aktarılabilir. Bu nedenle, PI oluşumu gerçekten tehlikeli toplanan türlerin varlığı belirli konumlara hücresinde, nerede onlar olabilir işlenen veya önemli yan etkileri olmadan birikmiş kısıtlar detoxifying bir mekanizma teşkil olabilir 13 , 14.
Standart vitro biyokimyasal yaklaşımlar toplama reaksiyonlar ve onların özellikleri15,16doldurmak farklı türlerin önemli anlayışlar hazırladık. Ancak, bu deneyleri içinde kullanılan koşulları açıkça farklı hücre içinde meydana gelen ve bu nedenle, kendi fizyolojik alaka soru. Protein kalite kontrol, autophagy veya Düzenleme Ökaryotlar19,20,21 arasında hücresel redoks devlet17,18 , gibi hücresel yolları önemli korunması nedeniyle ,22,23, tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) protein toplama moleküler belirleyicileri çalışmaya ayrıcalıklı basit bir hücresel model çıkmıştır ve ilişkili sitotoksik etkisini de biyolojik olarak uygun ortamlar24,25,26.
Protein toplama eğilimi doğal olarak birincil sırada kodlanmış bir özelliktir. Böylece, amiloid benzeri yapıların oluşumu kimlik ve toplama teşvik potens değerlendirilmesi dayalı tahmin edilebilir polipeptitler27bölgelerde. Ancak, protein sequences vitro toplama özelliklerini tahmin etmek için bioinformatic algoritmaları başarı rağmen bunlar hala bu eğilimlerini vivo içinde sitotoksik etki nasıl tercüme tahmini çok uzak. Belirli bir protein toplanan durumunu ve onun ilişkili hücresel hasarı arasındaki bağlantıyı sistematik bir şekilde ele alan çalışmalar Hesaplamalı bu sınırlamayı aşmak için yardımcı olabilir. Bu bağlantı yalnızca tek bir kalıntı farklı ama toplama eğilimlerini vivo içinde28sürekli bir dizi görüntüleme β-amiloid peptid Aβ42 türevleri büyük bir set yararlanarak bu da çalışmanın, yöneliktir. Maya hücreleri toplama eğilimli proteinler tarafından elde edildi oksidatif hasar için muhasebe konformasyon türler tanımlamak için FC dayalı bir yaklaşım özellikle de açıklanmıştır. Metodoloji basitlik, yüksek üretilen iş yetenekleri ve doğru nicel ölçüm gibi birçok avantaj sağlar. Bu yaklaşım o PI oksidatif strese karşı koruyucu bir rol oynar teyit mümkün kıldı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çok çeşitli hastalıklar misfolded proteinleri birikimi hücresel mevduat6,7,8,33içine bağlıdır. Birçok çabaları rapor protein konsantrasyonları almayın, Hesaplamalı yaklaşımları kullanarak bu hastalıkların başlangıcı tetiklemek moleküler mekanizmaları çözmeye gelmiş yapılmış veya vitro yaklaşımları, içinde protein konsantrasyonu reaksiyon sırasında s…
Acknowledgements
Materials
| Yeast cells BY4741 | ATCC | 201388 | Genotype: MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 |
| pESC(-Ura) plasmid | Agilent Genomics | 217454 | Yeast expression plasmid with a Gal promotor. Selectable marker URA3 |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | Sigma | Y1501 | Powder |
| Yeast Nitrogen Base Without Amino Acids | Sigma | Y0626 | Powder |
| Raffinose | Sigma | R7630 | Powder |
| Glucose | Sigma | G7021 | Powder |
| Galactose | Sigma | G0750 | Powder |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3991 | Solution 10X |
| CellROX Deep Red Reagent | Life Technologies | C10422 | Free radical cell-permeant fluorescent sensor, non-fluorescent while in a reduced state, and exhibits bright fluorescence upon oxidation by reactive oxygen species (ROS), with absorption/emission maxima at 644/665 nm. |
| Y-PER protein extraction reagent | Thermo Scientific | 78990 | Liquid cell lysis buffer |
| Acrylamide/Bis-acrylamide | Sigma | A6050 | Solution |
| Bradford dye reagent | Bio-Rad | 5000205 | Dye reagent for one-step determination of protein concentration |
| β-amyloid antibody 6E10 | BioLegend | 803001 | Mouse IgG1. The epitope lies within amino acids 3-8 of beta amyloid (EFRHDS). |
| Goat anti-mouse IgG-HRP conjugate | Bio-Rad | 1721011 | |
| Membrane Immobilon-P, PVDF | Millipore | IPVH00010 | |
| Luminata forte | Merk | WBLUF0100 | Premixed, ready to use chemiluminescent HRP detection reagent |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride solution (PMSF) | Sigma | 93482 | Protease inhibitor. Dissolved at 0.1 M in ethanol |
| FACSCanto flow cytometer | BD Biosciences | 657338 | Equipped with a 488 nm blue laser for the detection of GFP, and 635 nm red laser / 530/30 nm BP filter and 660/20 BP filter |
| Mini Trans-Blot Electrophoresis Transfer cell | Bio-Rad | 1703930 | Protein transference system |
| Mini-PROTEAN Tetra Handcast Systems | Bio-Rad | 1658000FC | Electrophoresis system |
References
- Frydman, J. Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones. Annual Review of Biochemistry. 70, 603-647 (2001).
- Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
- Wong, E., et al. Molecular determinants of selective clearance of protein inclusions by autophagy. Nature Communications. 3, (2012).
- Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. Chaperone networks in protein disaggregation and prion propagation. Journal of Structural Biology. 179, 152-160 (2012).
- Glickman, M. H., Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: destruction for the sake of construction. Physiological Reviews. 82, 373-428 (2002).
- Dobson, C. M. Getting out of shape. Nature. 418, 729-730 (2002).
- Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).
- Aguzzi, A., O’Connor, T. Protein aggregation diseases: pathogenicity and therapeutic perspectives. Nature Reviews Drug Discovery. 9, 237-248 (2010).
- Rapezzi, C., et al. Transthyretin-related amyloidoses and the heart: a clinical overview. Nature Reviews Cardiology. 7, 398-408 (2010).
- Deas, E., et al. Alpha-synuclein oligomers interact with metal ions to induce oxidative stress and neuronal death in Parkinson’s disease. Antioxidants & Redox Signaling. 24, 376-391 (2016).
- Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 301-307 (2010).
- Frost, B., Diamond, M. I. Prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases. Nature Reviews Neuroscience. 11, 155-159 (2009).
- Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death. Nature. 431, 805-810 (2004).
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Opinion: what is the role of protein aggregation in neurodegeneration?. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 891-898 (2005).
- Mishra, R., Sjölander, D., Hammarström, P. Spectroscopic characterization of diverse amyloid fibrils in vitro by the fluorescent dye Nile red. Molecular BioSystems. 7, 1232-1240 (2011).
- Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. Quantifying amyloid by congo red spectral shift assay. Methods in Enzymology. 309, 285-305 (1999).
- Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker’s yeast?. Nature Reviews Neuroscience. 11, 436-449 (2010).
- Tenreiro, S., Outeiro, T. F. Simple is good: yeast models of neurodegeneration. FEMS Yeast Research. 10, 970-979 (2010).
- Moosavi, B., Mousavi, B., Macreadie, I. G. Yeast model of amyloid-β and Tau aggregation in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 47, 9-16 (2015).
- Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration. Journal of Neurochemistry. 127, 438-452 (2013).
- Yang, J., Hao, X., Cao, X., Liu, B., Nyström, T. Spatial sequestration and detoxification of huntingtin by the ribosome quality control complex. eLife. 5, (2016).
- Braun, R. J., Büttner, S., Ring, J., Kroemer, G., Madeo, F. Nervous yeast: modeling neurotoxic cell death. Trends in Biochemical Sciences. 35, 135-144 (2010).
- Figley, M. D., Gitler, A. D. Yeast genetic screen reveals novel therapeutic strategy for ALS. Rare Diseases. 1, e24420 (2013).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson’s models. Science. 313, 324-328 (2006).
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 6439-6444 (2008).
- Bharathi, V., et al. Use of ade1 and ade2 mutations for development of a versatile red/white color assay of amyloid-induced oxidative stress in saccharomyces cerevisiae. Yeast. 33, 607-620 (2016).
- Pallarès, I., Ventura, S. Advances in the prediction of protein aggregation propensity. Current Medicinal Chemistry. , (2017).
- Villar-Piqué, A., Ventura, S. Protein aggregation propensity is a crucial determinant of intracellular inclusion formation and quality control degradation. Biochimica et Biophysica Acta. 1833, 2714-2724 (2013).
- Navarro, S., Villar-Piqué, A., Ventura, S. Selection against toxic aggregation-prone protein sequences in bacteria. Biochimica et Biophysica Acta. 1843, 866-874 (2014).
- Morell, M., de Groot, N. S., Vendrell, J., Avilés, F. X., Ventura, S. Linking amyloid protein aggregation and yeast survival. Molecular BioSystems. 7, 1121-1128 (2011).
- Conchillo-Solé, O., et al. AGGRESCAN: a server for the prediction and evaluation of "hot spots" of aggregation in polypeptides. BMC Bioinformatics. 8, 65 (2007).
- Fernandez-Escamilla, A. M., Rousseau, F., Schymkowitz, J., Serrano, L. Prediction of sequence-dependent and mutational effects on the aggregation of peptides and proteins. Nature Biotechnology. 22, 1302-1306 (2004).
- Renner, M., Melki, R. Protein aggregation and prionopathies. Pathologie Biologie.(Paris). 62, 162-168 (2014).
- Carija, A., Navarro, S., de Groot, N. S., Ventura, S. Protein aggregation into insoluble deposits protects from oxidative stress. Redox Biology. 12, 699-711 (2017).
