Avaliação do impacto da agregação da proteína no estresse oxidativo celular na levedura
Summary
Agregação da proteína provoca estresse oxidativo celular. Este protocolo descreve um método para monitorar os Estados intracelulares de proteínas amiloidogénicos e o stress oxidativo associado a eles, usando citometria de fluxo. A abordagem é usada para estudar o comportamento de variantes do peptídeo β-amiloide solúveis e propensas a agregação.
Abstract
Enrolamento de proteínas e de agregação em conformações amiloides têm sido relacionados ao aparecimento e progressão de várias doenças neurodegenerativas. No entanto, ainda há pouca informação sobre proteína insolúvel como agregados exercem seus efeitos tóxicos em vivo. Organismos-modelo simples de procariotas e eucariotas, tais como bactérias e leveduras, têm contribuído significativamente para nossa compreensão atual dos mecanismos por trás da formação de amiloide intracelular, propagação de agregados e toxicidade. Neste protocolo, o uso de levedura é descrito como um modelo para dissecar a relação entre a formação de agregados de proteínas e seu impacto sobre o estresse oxidativo celular. O método combina a detecção de estado solúvel/agregados intracelular de uma proteína amiloidogénicos com a quantificação dos danos oxidativos celulares resultantes de sua expressão usando citometria de fluxo (FC). Essa abordagem é simples, rápido e quantitativo. O estudo ilustra a técnica correlacionando o estresse oxidativo celular, causado por um conjunto grande de variantes de peptídeo β-amiloide com suas propensões respectiva agregação intrínseca.
Introduction
Proteostasis é um determinante fundamental dos processos de adequação e envelhecimento celular. Nas células, homeostase de proteína é mantida pelo controle de qualidade de proteína sofisticadas redes visa garantir a correta dobrar de conformistas de misfolded proteínas por acompanhantes e/ou sua proteólise alvejado com vários mecanismos bem conservados1 ,2,3,4,5. Um grande número de estudos oferece suporte à ligação entre o início e a progressão de uma ampla gama de doenças humanas e o fracasso de proteostasis, levando ao enrolamento de proteínas e agregação. Por exemplo, a presença de depósitos de proteína é considerada uma característica patológica de muitas doenças neurodegenerativas, como Alzheimer, Parkinson e Huntington doenças6,7,8, doenças prionogenic e amyloidoses não-degenerativas9. Tem sido sugerido que cedo assemblies oligoméricos e protofibrillar na reação de agregação são os principais elicitores de citotoxicidade, estabelecendo interações aberrantes com outras proteínas no meio lotado de celular10. Além disso, inclusões de proteína (PI) podem ser transmitidos entre as células, seus efeitos tóxicos11,12de propagação. Portanto, pode ser que a formação de PI de fato pode constituir um mecanismo desintoxicante que restringe a presença de espécies perigosas agregados para locais específicos na célula, onde eles podem ser processados ou acumulados sem grandes efeitos colaterais 13 , 14.
Padrão em vitro abordagens bioquímicas forneceram importantes insights sobre as diferentes espécies que povoam as reações de agregação e suas propriedades de15,16. No entanto, as condições usadas nestes ensaios são claramente diferentes das que ocorrem dentro da célula e, portanto, questionar sua relevância fisiológica. Por causa de conservação notável dos caminhos celulares tais como controle de qualidade de proteína, autofagia ou o Regulamento do estado redox celular17,18 entre eucariotas19,20,21 ,22,23, a brotamento de levedura Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) surgiu como um modelo de celular simples privilegiado para estudar os determinantes moleculares de agregação da proteína e seu impacto associado citotóxico em ambientes biologicamente relevantes24,25,26.
Propensão de agregação de proteínas é uma característica inerentemente codificada na sequência principal. Assim, a formação de estruturas semelhantes a amiloide pode ser prevista com base na identificação e avaliação da potência de agregação-promover regiões em polipeptídeos27. No entanto, apesar do sucesso de bioinformatic algoritmos para prever as propriedades de agregação em vitro de sequências de proteínas, eles estão ainda longe de previsão como essas propensões traduzem na vivo citotóxicos impacto. Estudos que abordam a relação entre o estado agregado de uma determinada proteína e seu dano celular associado de forma sistemática podem ajudar a contornar essa limitação computacional. Esta conexão é abordada no presente estudo, aproveitando-se de um conjunto grande de variantes do peptídeo β-amiloide Aβ42 diferindo apenas em um único resíduo, mas indicando uma escala contínua de agregação propensões na vivo28. Em particular, uma abordagem baseada em FC para identificar a espécie conformacional representando o dano oxidativo eliciado propensas a agregação de proteínas nas células de levedura é descrita. A metodologia oferece muitas vantagens como simplicidade, capacidade de alta produtividade e precisão das medições quantitativo. Esta abordagem, foi possível confirmar essa jogada de PI um papel protetor contra o estresse oxidativo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uma ampla gama de doenças está ligada ao acúmulo de misfolded proteínas em depósitos celulares6,7,8,33. Muitos esforços foram feitos para desvendar os mecanismos moleculares que desencadeiam o aparecimento destas doenças usando abordagens computacionais, que não levam em concentrações de proteína de conta, ou em vitro se aproxima, em que a concentração de proteína mantém…
Acknowledgements
Materials
| Yeast cells BY4741 | ATCC | 201388 | Genotype: MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 |
| pESC(-Ura) plasmid | Agilent Genomics | 217454 | Yeast expression plasmid with a Gal promotor. Selectable marker URA3 |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | Sigma | Y1501 | Powder |
| Yeast Nitrogen Base Without Amino Acids | Sigma | Y0626 | Powder |
| Raffinose | Sigma | R7630 | Powder |
| Glucose | Sigma | G7021 | Powder |
| Galactose | Sigma | G0750 | Powder |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3991 | Solution 10X |
| CellROX Deep Red Reagent | Life Technologies | C10422 | Free radical cell-permeant fluorescent sensor, non-fluorescent while in a reduced state, and exhibits bright fluorescence upon oxidation by reactive oxygen species (ROS), with absorption/emission maxima at 644/665 nm. |
| Y-PER protein extraction reagent | Thermo Scientific | 78990 | Liquid cell lysis buffer |
| Acrylamide/Bis-acrylamide | Sigma | A6050 | Solution |
| Bradford dye reagent | Bio-Rad | 5000205 | Dye reagent for one-step determination of protein concentration |
| β-amyloid antibody 6E10 | BioLegend | 803001 | Mouse IgG1. The epitope lies within amino acids 3-8 of beta amyloid (EFRHDS). |
| Goat anti-mouse IgG-HRP conjugate | Bio-Rad | 1721011 | |
| Membrane Immobilon-P, PVDF | Millipore | IPVH00010 | |
| Luminata forte | Merk | WBLUF0100 | Premixed, ready to use chemiluminescent HRP detection reagent |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride solution (PMSF) | Sigma | 93482 | Protease inhibitor. Dissolved at 0.1 M in ethanol |
| FACSCanto flow cytometer | BD Biosciences | 657338 | Equipped with a 488 nm blue laser for the detection of GFP, and 635 nm red laser / 530/30 nm BP filter and 660/20 BP filter |
| Mini Trans-Blot Electrophoresis Transfer cell | Bio-Rad | 1703930 | Protein transference system |
| Mini-PROTEAN Tetra Handcast Systems | Bio-Rad | 1658000FC | Electrophoresis system |
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