Bewertung der Auswirkungen der Proteinaggregation auf zellulären oxidativen Stress in der Hefe
Summary
Proteinaggregation entlockt zellulären oxidativen Stress. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Überwachung der intrazellulären Staaten von Amyloidogenic Proteinen und den oxidativen Stress zugeordnet werden, mit Hilfe der Durchflusszytometrie. Der Ansatz dient zur Untersuchung des Verhaltens von löslichen und Aggregation neigende Varianten des β-Amyloid Peptids.
Abstract
Protein misfolding und Aggregation in Amyloid Konformationen haben an der Entstehung und Progression von mehreren neurodegenerativen Erkrankungen in Zusammenhang gebracht. Allerdings gibt es noch wenig Informationen über wie unlöslichen Protein Aggregate ihre toxische Wirkung in Vivoausüben. Einfaches Modell der prokaryotischen und eukaryotischen Organismen, wie Bakterien und Hefen, trugen wesentlich zur unsere gegenwärtigen Verständnis der Mechanismen hinter der intrazellulären Amyloid Bildung, Aggregate Ausbreitung und Toxizität. In diesem Protokoll bezeichnet man die Verwendung von Hefe als ein Modell, um die Beziehung zwischen der Entstehung von Protein-Aggregate und ihre Auswirkungen auf die zellulären oxidativen Stress zu sezieren. Die Methode verbindet die Erkennung der intrazellulären löslich/aggregiert Bundesstaat ein Amyloidogenic Protein mit der Quantifizierung der zellulären oxidativen Schäden, die aus ihren Ausdruck mit Durchflusszytometrie (FC). Dieser Ansatz ist einfach, schnell und quantitative. Die Studie zeigt die Technik durch Korrelation der zellulären oxidativen Stress, verursacht durch eine große Anzahl von Amyloid-β-Peptid-Varianten mit ihren jeweiligen inneren Aggregation Neigungen.
Introduction
Proteostase ist eine wesentliche Determinante des Zellprozesse Fitness und Alterung. In den Zellen bleibt Protein Homöostase durch anspruchsvolle Protein-Qualitätskontrolle, die Netzwerke zielte darauf ab, sicherzustellen, das richtige umfaltung fehlgefaltete Protein Konformere durch Chaperone und/oder ihre gezielten Proteolyse mit mehreren gut erhaltenen Mechanismen1 ,2,3,4,5. Eine große Anzahl von Studien unterstützen die Verbindung zwischen der Entstehung und Progression von ein breites Spektrum von Erkrankungen des Menschen und das Scheitern der proteostase, führt zu Protein misfolding und Aggregation. Zum Beispiel gilt das Vorhandensein von Proteinablagerungen eine pathologische Gütesiegel von vielen neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson und Huntington Krankheiten6,7,8, Prionogenic Krankheiten, und nicht-degenerativen Amyloidosen9. Es wurde vermutet, dass frühe Oligomere und Protofibrillar Baugruppen in der Aggregation Reaktion die wichtigsten spüren der Zytotoxizität sind, aberrante Interaktionen mit anderen Proteinen in den überfüllten zellulären Milieu10Aufbau. Darüber hinaus können Protein Einschlüsse (PI) zwischen den Zellen, verbreiten ihre toxische Wirkung11,12übertragen werden. Daher könnte es sein, dass die Bildung von PI in der Tat einen entgiftenden Mechanismus, der das Vorhandensein von gefährlichen aggregierten Arten zu bestimmten Stellen in der Zelle beschränkt darstellen, wo sie verarbeitet oder angesammelt ohne große Nebenwirkungen 13 , 14.
Standard in-vitro- biochemische Ansätze lieferten wichtige Einblicke in die verschiedenen Arten, die Aggregation Reaktionen und ihre Eigenschaften15,16bevölkern. Jedoch Bedingungen verwendet in diesen Tests unterscheiden sich deutlich von denen, die innerhalb der Zelle und ihre physiologische Bedeutung daher in Frage zu stellen. Aufgrund der bemerkenswerten Erhaltung zelluläre Signalwege wie Protein-Qualitätskontrolle, Autophagie oder die Regulierung der zellulären Redox Zustand17,18 unter Eukaryoten19,20,21 ,22,23, die angehende Hefe Saccharomyces Cerevisiae (S. Cerevisiae) entstanden als privilegierte einfaches zellulären Modell, die molekulare Determinanten der Proteinaggregation zu studieren und seiner zugehörigen zytotoxische Wirkung auf biologisch relevante Umgebungen24,25,26.
Protein Aggregation Neigung ist eine Funktion, die von Natur aus in der primären Sequenz codiert. So kann die Bildung der Amyloid-ähnliche Strukturen vorhergesagt werden, basierend auf die Identifikation und Bewertung der Potenz der Aggregation-Förderung Regionen in Polypeptide27. Trotz des Erfolgs der bioinformatische Algorithmen, die in-vitro- Aggregation-Eigenschaften von Proteinsequenzen vorherzusagen, sind sie jedoch noch lange nicht vorhersagen, wie diese Neigungen in in Vivo zytotoxische Wirkung zu übersetzen. Studien, die die Verbindung zwischen den aggregierten Zustand eines gegebenen Proteins und seiner damit verbundenen Zellschädigung in systematischer Weise ansprechen können helfen, um diese rechnerische Einschränkung zu umgehen. Diese Verbindung ist in der vorliegenden Studie, unter Ausnutzung von einer großen Anzahl von Varianten des β-Amyloid Peptids Aβ42 unterscheiden sich nur in einer einzigen Rückstand, aber Anzeige einen fortlaufenden Bereich von Aggregation Neigungen in Vivo28gerichtet. Insbesondere bezeichnet man ein FC-Ansatz für die Konformationsänderungen Arten entfallen die oxidativen Schäden hervorgerufen durch Aggregation neigen Proteine in Hefezellen zu identifizieren. Die Methode bietet viele Vorteile wie Einfachheit, Hochdurchsatz-Fähigkeit und genaue quantitative Messung. Dieser Ansatz ermöglichte es, dass PI eine schützende Rolle gegen oxidativen Stress spielen zu bestätigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine Vielzahl von Krankheiten ist die Anhäufung von fehlgefaltete Proteine in zellulären Einlagen6,7,8,33verbunden. Wurden viele Anstrengungen unternommen, um die molekularen Mechanismen zu entwirren, die das Auftreten dieser Krankheiten mit rechnerische Ansätze, die nicht ins Konto proteinkonzentrationen nehmen, auslösen oder in-vitro- Ansätze, in denen die Proteinkonzentration w…
Acknowledgements
Materials
| Yeast cells BY4741 | ATCC | 201388 | Genotype: MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 |
| pESC(-Ura) plasmid | Agilent Genomics | 217454 | Yeast expression plasmid with a Gal promotor. Selectable marker URA3 |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | Sigma | Y1501 | Powder |
| Yeast Nitrogen Base Without Amino Acids | Sigma | Y0626 | Powder |
| Raffinose | Sigma | R7630 | Powder |
| Glucose | Sigma | G7021 | Powder |
| Galactose | Sigma | G0750 | Powder |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3991 | Solution 10X |
| CellROX Deep Red Reagent | Life Technologies | C10422 | Free radical cell-permeant fluorescent sensor, non-fluorescent while in a reduced state, and exhibits bright fluorescence upon oxidation by reactive oxygen species (ROS), with absorption/emission maxima at 644/665 nm. |
| Y-PER protein extraction reagent | Thermo Scientific | 78990 | Liquid cell lysis buffer |
| Acrylamide/Bis-acrylamide | Sigma | A6050 | Solution |
| Bradford dye reagent | Bio-Rad | 5000205 | Dye reagent for one-step determination of protein concentration |
| β-amyloid antibody 6E10 | BioLegend | 803001 | Mouse IgG1. The epitope lies within amino acids 3-8 of beta amyloid (EFRHDS). |
| Goat anti-mouse IgG-HRP conjugate | Bio-Rad | 1721011 | |
| Membrane Immobilon-P, PVDF | Millipore | IPVH00010 | |
| Luminata forte | Merk | WBLUF0100 | Premixed, ready to use chemiluminescent HRP detection reagent |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride solution (PMSF) | Sigma | 93482 | Protease inhibitor. Dissolved at 0.1 M in ethanol |
| FACSCanto flow cytometer | BD Biosciences | 657338 | Equipped with a 488 nm blue laser for the detection of GFP, and 635 nm red laser / 530/30 nm BP filter and 660/20 BP filter |
| Mini Trans-Blot Electrophoresis Transfer cell | Bio-Rad | 1703930 | Protein transference system |
| Mini-PROTEAN Tetra Handcast Systems | Bio-Rad | 1658000FC | Electrophoresis system |
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