Valutazione dell'impatto dell'aggregazione proteica su Stress ossidativo cellulare nel lievito
Summary
L’aggregazione della proteina induce stress ossidativo cellulare. Questo protocollo descrive un metodo per il monitoraggio degli Stati intracellulari di proteine amiloidogeniche e lo sforzo ossidativo connesso con loro, mediante citometria a flusso. L’approccio viene utilizzato per studiare il comportamento delle varianti solubile e soggetto a aggregazione del peptide amiloide-β.
Abstract
Misfolding e aggregazione amiloide conformazioni hanno riguardati l’insorgenza e la progressione di parecchie malattie neurodegenerative. Tuttavia, ci sono ancora poche informazioni sulla proteina insolubile come aggregati esercitano loro effetti tossici in vivo. Organismi di modello semplice di procarioti ed eucarioti, come batteri e lieviti, hanno contribuito notevolmente alla nostra comprensione attuale dei meccanismi dietro la formazione intracellulare dell’amiloide, propagazione di aggregati e tossicità. In questo protocollo, l’uso del lievito è descritto come un modello da dissezionare il rapporto tra la formazione di aggregati proteici e del loro impatto su stress ossidativo cellulare. Il metodo combina la rilevazione dello stato solubile/aggregati intracellulare di proteina amiloidogenica con la quantificazione del danno ossidativo cellulare derivanti dalla sua espressione mediante citometria a flusso (FC). Questo approccio è semplice, veloce e quantitativa. Lo studio illustra la tecnica correlando lo stress ossidativo cellulare causato da una vasta serie di varianti del peptide amiloide-β con loro propensioni di aggregazione intrinseco rispettivi.
Introduction
Proteostasis è un determinante fondamentale dei processi di fitness e invecchiamento delle cellule. Nelle cellule, omeostasi della proteina è mantenuto da controllo di qualità di proteina sofisticate reti intendevano ad assicurare il corretto ripiegamento di conformeri proteine misfolded da accompagnatori e/o loro proteolisi mirata con diversi meccanismi ben conservati1 ,2,3,4,5. Un gran numero di studi fornisce il supporto per il collegamento tra l’inizio e la progressione di una vasta gamma di malattie umane e il fallimento di proteostasis, che conduce al misfolding e aggregazione. Per esempio, la presenza di depositi proteici è considerata un marchio di garanzia patologico di molti disordini neurodegenerative, quali Alzheimer, Parkinson e malattie6,7,8, di Huntington prionogenic malattie e non degenerativa amiloidosi9. È stato suggerito che presto assembly oligomerici e protofibrillar nella reazione di aggregazione sono i principale elicitori di citotossicità, stabilendo aberrante interazioni con altre proteine nell’ affollato ambiente cellulare10. Inoltre, inclusioni di proteina (PI) possono essere trasmessi tra le cellule, propagando il loro effetto tossico11,12. Di conseguenza, potrebbe essere che la formazione di PI potrebbe infatti costituire un meccanismo di disintossicazione che limita la presenza di specie pericolose aggregati a posizioni specifiche in cella, dove possono essere elaborati o accumulati senza effetti secondari importanti 13 , 14.
Standard in vitro approcci biochimici hanno fornito importanti intuizioni le diverse specie che popolano le reazioni di aggregazione e loro proprietà15,16. Tuttavia, le condizioni utilizzate in queste analisi sono chiaramente diverse da quelli che si verificano all’interno della cellula e, pertanto, chiedo loro rilevanza fisiologica. A causa della notevole conservazione delle vie cellulari come controllo di qualità di proteine, l’autofagia o il regolamento del17,stato redox cellulare18 tra eucarioti19,20,21 ,22,23, il lievito Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) è emerso come un modello di cellulare semplice privilegiato per studiare i determinanti molecolari dell’aggregazione proteica e il suo impatto citotossico associato in ambienti biologicamente rilevanti24,25,26.
Propensione di aggregazione della proteina è una caratteristica intrinsecamente codificata nella sequenza primaria. Così, la formazione di amiloide-come le strutture può essere preveduta basato sull’identificazione e la valutazione della potenza di aggregazione-promuovere le regioni polipeptidi27. Tuttavia, nonostante il successo di algoritmi bioinformatici per predire le proprietà di aggregazione in vitro di sequenze proteiche, sono ancora lontano da come queste propensioni si traducono in vivo effetto citotossico di previsione. Gli studi che affrontano il legame tra lo stato aggregato di una data proteina e suoi associato danno cellulare in maniera sistematica possono contribuire ad per aggirare questa limitazione computazionale. Questa connessione è indirizzata nello studio presente, approfittando di un grande insieme di varianti del peptide amiloide-β Aβ42 differiscono solo per un singolo residuo, ma la visualizzazione di un intervallo continuo di aggregazione propensioni in vivo28. In particolare, è descritto un approccio basato su FC per identificare la specie conformazionale contabilità per il danno ossidativo suscitato da aggregazione-incline proteine in cellule di lievito. La metodologia fornisce molti vantaggi come la semplicità, funzionalità di alto-rendimento e accurata misurazione quantitativa. Questo approccio ha permesso di confermare che svolgono un ruolo protettivo contro lo sforzo ossidativo di PI.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una vasta gamma di malattie è legata all’accumulo di proteine misfolded in depositi cellulari6,7,8,33. Molti sforzi sono stati fatti per svelare i meccanismi molecolari che determinano l’insorgenza di queste malattie utilizzando approcci computazionali, che non tengono in concentrazioni di proteina di conto, o in vitro si avvicina, in cui la concentrazione nella proteina rimane costan…
Acknowledgements
Materials
| Yeast cells BY4741 | ATCC | 201388 | Genotype: MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 |
| pESC(-Ura) plasmid | Agilent Genomics | 217454 | Yeast expression plasmid with a Gal promotor. Selectable marker URA3 |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | Sigma | Y1501 | Powder |
| Yeast Nitrogen Base Without Amino Acids | Sigma | Y0626 | Powder |
| Raffinose | Sigma | R7630 | Powder |
| Glucose | Sigma | G7021 | Powder |
| Galactose | Sigma | G0750 | Powder |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3991 | Solution 10X |
| CellROX Deep Red Reagent | Life Technologies | C10422 | Free radical cell-permeant fluorescent sensor, non-fluorescent while in a reduced state, and exhibits bright fluorescence upon oxidation by reactive oxygen species (ROS), with absorption/emission maxima at 644/665 nm. |
| Y-PER protein extraction reagent | Thermo Scientific | 78990 | Liquid cell lysis buffer |
| Acrylamide/Bis-acrylamide | Sigma | A6050 | Solution |
| Bradford dye reagent | Bio-Rad | 5000205 | Dye reagent for one-step determination of protein concentration |
| β-amyloid antibody 6E10 | BioLegend | 803001 | Mouse IgG1. The epitope lies within amino acids 3-8 of beta amyloid (EFRHDS). |
| Goat anti-mouse IgG-HRP conjugate | Bio-Rad | 1721011 | |
| Membrane Immobilon-P, PVDF | Millipore | IPVH00010 | |
| Luminata forte | Merk | WBLUF0100 | Premixed, ready to use chemiluminescent HRP detection reagent |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride solution (PMSF) | Sigma | 93482 | Protease inhibitor. Dissolved at 0.1 M in ethanol |
| FACSCanto flow cytometer | BD Biosciences | 657338 | Equipped with a 488 nm blue laser for the detection of GFP, and 635 nm red laser / 530/30 nm BP filter and 660/20 BP filter |
| Mini Trans-Blot Electrophoresis Transfer cell | Bio-Rad | 1703930 | Protein transference system |
| Mini-PROTEAN Tetra Handcast Systems | Bio-Rad | 1658000FC | Electrophoresis system |
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