كريسبر بوساطة إعادة تنظيم هيكل حلقة الكروماتين
1Department of Dermatology, Program in Epithelial Biology,Stanford University School of Medicine, 2Program in Cancer Biology,Stanford University School of Medicine, 3Canary Center for Cancer Early Detection, Department of Radiology,Stanford University School of Medicine, 4Department of Biology,Bridgewater State University, 5System Biosciences, 6Veterans Affairs Healthcare System
Summary
حلقات الكروماتين تلعب دوراً هاما في تنظيم الجينات؛ ومع ذلك، كانت هناك لا التطورات التكنولوجية التي تسمح بتعديل حلقات الكروماتين انتقائية وعكسها. هنا يصف لنا نظاما قويا للونين حلقة إعادة تنظيم استخدام كريسبر-dCas9 (CLOuD9)، أظهرت بصورة انتقائية وعكسية تعدل التعبير الجيني في استهداف المكاني.
Abstract
الدراسات التي أجريت مؤخرا أظهرت بوضوح أن الكروماتين بعيد المدى، وثلاثي الأبعاد حلقات التفاعلات تلعب دوراً هاما في تنظيم التعبير الجيني، لكن إذا كان التكرار المسؤول عن أو نتيجة للتعديلات في التعبير الجيني لا يزال غير معروف. وحتى وقت قريب، حلقات الكروماتين يؤثر على كيفية تنظيم نشاط الجين ووظيفة الخلوية كانت غامضة نسبيا، وأوجه القصور في الأساليب الحالية التعامل مع هذه الهياكل منع استكشاف متعمق لهذه التفاعلات. لحل هذا الغموض، يمكننا إجراء هندسة عكسية طريقة الكروماتين انتقائية وعكسها حلقة إعادة تنظيم استخدام كريسبر-dCas9 (CLOuD9). قد تجلت دينامية النظام CLOuD9 الترجمة الناجحة من بنيات CLOuD9 لاستهداف المكاني الجينوم تعدل تشكيل الكروماتين المحلية. الأهم من ذلك، قد أكد أيضا القدرة على عكس المستحث بجهة الاتصال وإعادة تكيف الكروماتين الذاتية. تعديل التعبير الجيني بهذا الأسلوب يحدد القدرة على تنظيم التعبير الجيني الخلوية ويبرز إمكانات كبيرة لتطبيقات هذه التكنولوجيا في خلق استقرار حيثياته الحلقات الكروماتين ملحوظ تؤثر على الجينات التعبير في السياقات السرطان والتنمية.
Introduction
العلاقة بين الكروماتين قابلة للطي في النواة ومنظمة محددة من الجينوم قد حصل على اهتمام كبير في السنوات الأخيرة، كما أنه ثبت أن تكون مرتبطة ارتباطاً وثيقا بالتعبير الجيني1،2. بينما العلاقة الدقيقة بين نشاط الجينات وتعديل هيكل الكروماتين لا يزال غير واضح، قد تم الافتراض بأن التفاعلات بين جهات الاتصال صبغية نتيجة تنظيم الكروماتين ثلاثي الأبعاد الحيوية تخدم وظيفة التنظيم الجيني3. والواقع أن هذا أثر قد ثبت جيدا في موضع الجينات البشرية جلوبين، حيث المنطقة موضع عنصر التحكم (LCR) وينظم نشاط الجينات جلوبين بطريقة محددة تنمويا بإنشاء حلقة الكروماتين بين المنطقتين4. ومع ذلك، في كل هذا، ومناطق أخرى، الواضح حلقات الكروماتين هو ما إذا كان سببا أو نتيجة للتعديلات في التعبير الجيني.
حتى الآن، ظلت التحديات في دراسة هذه الظاهرة التي لم تحل. على سبيل المثال، تشارك سائر المحاولات الرامية إلى حمل الحلقات الكروماتين تعديل تسلسل الحمض النووي الخطي أو إجراءات معقدة تتطلب وفرة معرفة الأساسية على عناصر محددة تسهل حلقات5،6، 7،8. بالإضافة إلى ذلك، بينما العمل السابقة قد اقترحت أن الكروماتين الحلقات محرك التعبير الجيني في سياق محدد ومقيد7،8، المستوى في الكروماتين الذي حلقات يؤثر النسخ عالمياً غير مؤكد. على الرغم من تزايد الاهتمام بتأثير حلقات طويلة المدى على التعبير الجيني باستمرار في السنوات الأخيرة، ما زالت قائمة الأسئلة حول إنشاء والاحتفاظ بجهات الاتصال الكروماتين لتغيير نشاط الجينات.
توظف التكنولوجيا التي كنا قد هندسيا نوكلاس ناقصة متفاوت المسافات بانتظام إينتيرسباسيد المتناوب قصيرة يكرر (كريسبر)-كريسبر-المرتبطة البروتين 9 (dCas9)، للسماح لاستهداف أي المكاني الجينوم9تنطبق على نطاق واسع. يحل المسائل المعقدة المتعلقة بإدخال تعديلات على تسلسل الحمض النووي الخطية هذه التكنولوجيا ويمكن الوصول إليها دون علم مسبق هام من مكونات حلقات خاصة. وأبرزها الأداة عالمية ونطاق واسع ينطبق على الحلقات الكروماتين المعترف بها في التنمية، فضلا عن مجموعة متنوعة من الأمراض، مثل السرطان. قوة CLOuD9 يتجلى بشكل قابل للعكس تغيير هيكل الحلقات شكل فعال تعدل التعبير الجيني.
Protocol
1-جرنة التصميم حدد أداة تصميم جرنة قياسية لتصميم دليل الكشف10. باستخدام أزواج مكملة ل ثوابت CLOuD9 المتقدمة سابقا9 (أي بناء على الأقل 1 S. aureus (CSA) 1 س. المقيّحة (CSP)) لكل تجربة. داخل أداة التصميم المحدد عبر الإنترنت، استخدم التسلسل بروتوسباسير المتاخمة عزر (بام) “نج” بطول 20 دليل بي بي ل CSP وبام تسلسل “نجرت” بطول 21 دليل لوكالة الفضاء الكندية. اختر أدلة تستند إلى خصوصية نقاط وتصميم أدلة على كل خيوط تحقيق أقصى قدر من فرص الحصول على دليل عمل. تأمر النوكليوتيد 2 كل دليل من إحدى الشركات مصنعة اليغو: للأمام اليغو، إضافة “كاككج” إلى نهاية 5 ‘تسلسل دليل، واليغو العكسية، وإضافة”آآك”إلى 5’ نهاية و “ج” إلى النهاية 3 ‘ قبل أن يأمر. وفي البداية، تصميم جرناس 3-5 لكل منطقة ذات الاهتمام، وتنتشر في منطقة بي بي 250-1000. تقييم جرنة استهداف الكفاءة على النحو التالي: جرناس استنساخ التعرف إلى بلازميد Cas9 نشطة (راجع الخطوة 3) وعابر ترانسفيكت إلى خلايا 293T (راجع الخطوة 4)11. تنمو خلايا لمد 2-3 في تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو) مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) و 1% البنسلين-ستربتوميسين (بكتيريا القلم)، ثم الحصاد واستخراج الحمض النووي الجينومي12. تضخيم المناطق المستهدفة بتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تشغيل المنتجات على 1.5% [اغروس] هلام وتنقية الأشرطة المناسبة. تنفيذ مقايسة endonuclease T7 كما هو موضح في جوشين، وآخرون. البروتوكول13،14.ملاحظة: خطوط إرشاد فعالة تلك العزم على قطع الحمض النووي في الموقع المستهدف. 2-خلية ثقافة الحفاظ على خلايا صحية وتقسيم نشاط الدولة. ل K562s، الثقافة في روزويل بارك التذكاري المعهد (ربمي) 1640 وسائل الإعلام مع القلم 10% FBS و 1% بكتيريا. ينمو K562s في 25 سم2 الرقبة ميال قارورة للصيانة وضبط كثافة الخلية إلى الخلايا 400,000 كل مل كل يوم. بعد قد تم ترانسدوسيد K562s مع بنيات CLOuD9، إضافة 2 ميكروغرام/مل بوروميسين و 100 ميكروغرام/مل هيجروميسين لصيانة وسائل الإعلام. ل 293Ts، الثقافة في تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو) مع 10% FBS و 1% القلم بكتيريا. ينمو 293Ts في 10 سم2 لوحات والانقسام عندما المتلاقية. 3-بلازميد إعداد وجرنا الإدراج15 ملاحظة: تتوفر خرائط بلازميد في التذييل والإشعال المستخدمة في التجارب المثال متوفرة في التكميلية الجدول 1. مزيج 5 ميكروغرام من بلازميد كريسبر لينتيفيرال مع 3 ميليلتر من بسمبي، 3 ميليلتر من “الفوسفاتيز القلوية”، ميليلتر 6 من 10 × المخزن المؤقت، وميليلتر 0.6 مم 100 الطازجة DTT. الحجم الإجمالي إلى 60 ميليلتر مع ddH2س واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة هضم وديفوسفوريلاتي بلازميد. هلام تنقية بلازميد هضمها والوت في ddH2o. ميليلتر 1 مزيج من كل من هذه الأدلة المزدوجة في 100 ميكرومتر مع 1 ميليلتر من 10 x T4 ربط المخزن المؤقت، 6.5 ميليلتر من ddH2س، و 0.5 ميليلتر بنك T4، تصل إلى 10 ميليلتر الحجم الإجمالي. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم منحدر وصولاً إلى 25 درجة مئوية في 5 درجة مئوية/دقيقة.ملاحظة: هذا سوف يصلب زوج أدلة. تمييع في أدلة الملدن (من الخطوة 3، 3) 1: 200 في ddH2o. ميكس 1 ميليلتر من بلازميد هضمها من الخطوة 3.2 مع 0.5 ميليلتر من الأدلة الواصلة المخفف من الخطوة 3، 4، ميليلتر 2.5 2 x المخزن المؤقت، 1 ميليلتر من ddH2س، و 0.5 ميليلتر من ليجاسى، جعل فعل إجمالي 5.5 ميليلتر. احتضان هذا في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة سد هذه الأدلة إلى بلازميد بسمبي هضمها. تحويل بلازميد الواصلة حديثا من الخطوة 3.5 إلى البكتيريا Stbl3 وتضخيم باستخدام أي أسلوب إعداد بلازميد. 4-لينتيفيروس الإنتاج لوحة هيموسيتوميتير باستخدام خلايا العد 750,000 293T كل بئر لبئر ستة والبذور لهم في دميم مع القلم 10% FBS و 1% بكتيريا. استخدام بئر واحدة لكل بناء. 24 ساعة بعد البذر، تغيير وسائل الإعلام إلى دميم جديدة خالية من المضادات الحيوية مع 10% FBS. في أنبوب واحد، يؤدي إلى تمييع ميليلتر 11 من كاشف تعداء على أساس المادة الدهنية مع 150 ميليلتر من المتوسط أوبتيميم، كل رد فعل11. في أنبوب منفصل، تمييع 2 ميكروغرام من بلازميد متجه لينتيفيرال CLOuD9 من الخطوة 3، 6، 0.35 ميكروغرام بمدلج/بري و 1 ميكروغرام من رؤيا برسف 0.65 ميكروغرام من pMD2.G مع 150 ميليلتر من المتوسط أوبتيميم، كل رد فعل11. لكل رد فعل، أضف الخلائط بلازميد لينتيفيرال المخفف للكاشف تعداء على أساس المادة الدهنية المخفف بنسبة 1:1، واحتضان لمدة 5 دقائق11. إضافة وحدة التخزين بالكامل لكل مجمع مختلط من الخطوة 4، 5 في الآبار الخاصة بكل منها من خلايا خالية من المضادات الحيوية 293T من الخطوة 4، 2. في وقت لاحق، جمع ح 48 الفيروسية إنتاج وسائط الإعلام التي بيبيتينج إلى أنبوب جديد وتدور إلى أسفل في 300 غرام x لمدة 5 دقائق. بعد الطرد المركزي، نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد لإزالة الحطام المتبقية من الخلية. استخدام وسائط إنتاج الفيروسية فورا لتوصيل الخلايا المستهدفة أو تجميد في-80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. 5-لينتيفيروس توصيل الخلايا إضافة 250 ميليلتر لكل بناء الفيروسية للفائدة (التي تتألف من تكميلية CLOuD9 والبلازميدات) إلى أنبوب مخروطي 15 مل يحتوي على خلايا 80,000 لتطبيق CLOuD9. إحضار الحجم الإجمالي لوسائل الإعلام في كل المخروطية إلى 1 مل مع وسائط خالية من المضادات الحيوية، وإضافة بوليبريني إلى تركز نهائي بين 1-8 ميكروغرام/مل (سوف تحتاج أقصى تركيز بوليبريني التسامح حسب نوع الخلية المستخدمة يحدد تجريبيا). تدور الخلايا في 800 x ز لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم ريسوسبيند بيبيتينج دون إزالة المادة طافية الفيروسية. نقل تعليق الخلية بأكملها إلى لوحة ثقافة خلية. 24 ساعة بعد توصيل، خلايا تدور إلى أسفل في 300 غرام x لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نضح المادة طافية الفيروسية وريسوسبيند الخلايا في الخلية العادية الثقافة الإعلامية. في اليوم التالي، إضافة بوروميسين (1 ميكروغرام/مل للخلايا 293T) وهيجروميسين (25 ميكروغرام/مل للخلايا 293T) إلى متوسط الثقافة الخلية لتحديد للخلايا ترانسدوسيد مضاعف. تجريبيا تحديد التركيزات المناسبة بوروميسين وهيجروميسين لنوع معين من خلية قبل بدء التجارب. إبقاء الخلايا في اختيار وسائل الإعلام لمالا يقل عن 3 د قبل أي تجارب المتلقين للمعلومات والاحتفاظ بها في اختيار وسائل الإعلام لمدة كل التجارب. 6-الخلية ثنائي وغسل أضف 1 ملم حمض التسقيط (ABA) أو تحديد وحدة تخزين ما يعادل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) لعناصر التحكم لثقافة الخلية ديميريزي CLOuD9 وترانسدوسيد الخلايا. استخدام أبا في غضون 6 أشهر تاريخ استلام وتبقى باردة، وحمايتها من الضوء في جميع أنحاء استخدام. ويمكن استخدام 2 مم أبا إذا لزم الأمر. تغيير وسائل الإعلام يوميا لتوفير أبا الطازجة (أو [دمس] لعناصر التحكم) لمدة التجارب.ملاحظة: لا يوجد حد لطول ثنائي حتى الآن لم يلاحظ. عكس ثنائي من خلال إزالة الوسائط التي تحتوي على رابطة المحامين الأمريكية وغسل الخلايا بما يكفي الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لتغطية سطح اللوحة، مرتين. وبعد ذلك، ثقافة الخلايا في وسائل الإعلام الحرة أبا للحفاظ على دولة ديميريزيد الأمم المتحدة. 7-إيمونوبريسيبيتيشن وشركاه-إيمونوبريسيبيتيشنز ملاحظة: جعل كافة المخازن المؤقتة طازجة وفورا قبل الاستخدام. وعقب انتهاء تجارب ثنائي، جمع وتدور أسفل الخلايا، ثم نضح المادة طافية. التشعب وتجميد أسفل الخلايا جعل مخزون جديد من 1% فورمالدهايد في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة باستخدام مواد جديدة. لكل الخلايا 2 مليون، ريسوسبيند برفق مع 1 مل من 1% فورمالدهايد في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق بالضبط، حين تناوب.ملاحظة: استخدام كمية الحد أدنى من 10 مل ل crosslinking الخلايا أقل من 10 مليون. آرو كروسلينكينج بالإضافة إلى جليكاين إلى نهائي تركز 0.125 M، متبوعاً بالحضانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، بينما تناوب. وتدور أسفل الخلايا يغسل x 1-2 مع برنامج تلفزيوني المثلج. ثم يمكن الكريات الخلية الإضافية المجمدة في النتروجين السائل وتخزينه في-80 درجة مئوية أو استخدامها على الفور.ملاحظة: سيتم عكس الحرارة crosslinks فورمالدهايد. إذا هرعت، يمكن تخزين الخلايا مباشرة في-80 درجة مئوية دون تجميد المفاجئة. إعداد المتقارن جسم/حبةملاحظة: قد تكون الظروف الأمثل لجسم المختار (أي، اختبار تحلل مختلف المخازن المؤقتة لتحلل الخلية وتؤدي الملكية الفكرية) جديرة بالاهتمام. المخازن المؤقتة المشتركة اثنين، فارنهام تحلل المخزن المؤقت و “ريبا تعديل” المخزن المؤقت، يمكن أن يكون لها تأثير كبير على كفاءة الملكية الفكرية والكفاءة سونيكيشن. يمكن الاطلاع على جميع التراكيب المخزن المؤقت في الجدول للمواد. بالإضافة إلى ذلك، أن نضع في اعتبارنا أن الكروماتين sonication قد يستغرق عدة ساعات حتى يكتمل. ريسوسبيند حبات من فورتيكسينج بإيجاز حسب الاقتضاء لجسم المختار. نقل مبلغ مناسب من حبات للتجربة إلى أنبوب 1.5 مل. وكنقطة انطلاق، استخدام 20 ميليلتر من حبات لكل 1 ميكروغرام من الأجسام المضادة. لا تقم بإضافة جسم حتى الآن.ملاحظة: استخدام 10 ميكروغرام جسم مع 200 ميليلتر من حبات ل 1 مغ إجمالي كنقطة انطلاق، إلا إذا كان من المعروف أن الجسم أكثر أو أقل كفاءة مما ينطوي هذا الأمر. للبروتينات وفرة منخفضة، وهذه النسبة قد تحتاج إلى تعديل. في حالة استخدام المخزن المؤقت لتحلل فارنهام، يغسل 3 x في المخزن المؤقت لتمييع الملكية الفكرية. في حالة استخدام المخزن المؤقت لتحلل ريبا، يغسل 3 x في المخزن المؤقت لتحلل ريبا. ريسوسبيند الخرز بحجم نهائي في المخزن المؤقت نفس من الخطوة 7.3.3 (إضعاف الملكية الفكرية أو المخزن المؤقت ريبا) هو > س 1 و < 5 × حجم الأولية. أي 100 ميليلتر حجم حبة الأولى، استخدم بين 100 و 500 ميليلتر استثارة النهائي وحدة التخزين. إضافة جسم الخرز غسلها الآن في بتركيز مناسب. جسم هكتار أو إشارة جيدة إلى ثوابت CLOuD9 الملكية الفكرية، استخدام الأجسام المضادة في 01:50 (ميكروغرام البروتين: البروتين ميكروغرام ليستي) واحتضان بين 8 + ح وبين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، في حين تناوب. وبدلاً من ذلك، احتضانها ح 2-4 في درجة حرارة الغرفة. إزالة المادة طافية من الخرز وتجاهل. أغسل حبات x 3 مع المخزن المؤقت الغسيل. ريسوسبيند في حجم الحد أدنى من المخزن المؤقت المستخدمة للحضانة بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة (إضعاف الملكية الفكرية أو ريبا المخزن المؤقت). تبقى باردة حتى جنبا إلى جنب مع البروتين ليستي. Sonicate الكروماتين أولاً الخلايا بالإضافة إلى تورم المخزن المؤقت إلى حبيبات الخلية على الجليد لمدة 10 دقائق، والتحريك الخلايا كل دقيقة قليلة للحيلولة دون تسوية.ملاحظة: عموما، 500 ميليلتر من تورم المخزن المؤقت هو إضافة إلى 25 مليون من الخلايا وتحجيم من هناك، ولكن هل عدم استخدام أقل من 500 ميليلتر المخزن المؤقت < الخلايا 25 مليون. دونس يدوياً عكس اتجاه عقارب الساعة وعكس اتجاه عقارب الساعة، 13 × كل منهما. تدور الأنوية لأسفل عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في س 1,500 غ. نضح المادة طافية تماما وكرر لإزالة المادة طافية المتبقية، ثم تزن بيليه الخلية في مغ. إضافة مثبطات البروتياز إلى المخزن المؤقت لتحلل أنوية (فارنهام المخزن المؤقت أو ريبا العازلة، أعلاه، اختر واحداً). إضافة مبلغ x 10 أنوية تحلل المخزن المؤقت إلى نويات الأعلاف ريسوسبيند (على سبيل المثال، إضافة 1 مل من المخزن المؤقت لتحلل أنوية لبيليه 0.100 ز). باختصار من دوامة لمدة 10 دقائق على الجليد.ملاحظة: الاحتفاظ في الاعتبار حجم الأنبوب sonication. حجم مثالي في كثير من الأحيان < 1 مل، حيث العينات قد تحتاج إلى تقسيم إذا كانت الكريات كبيرة جداً. لشركة للملكية الفكرية، sonicate الأنوية بإيجاز جعل المواد واخماد مخزونات النشر الاستراتيجي إلى مستوى الذي يسمح إيمونوبريسيبيتيشن بحجم 2-3 إضعاف المخزن المؤقت، ثم المضي قدما إلى الخطوة 7.4.6. لأجسام حساسة جداً، إضافة أكثر من المخزن المؤقت تمييع للحد من زيادة تركيز الحزب الديمقراطي الصربي.ملاحظة: إيقاف sonication عند مسح ليستي؛ أنها ستغير من معتم/شفاف أبيض إلى شفاف تماما. الاحتفاظ بعينات الباردة قدر الإمكان ولا على sonicate. للرقائق، دقة sonicate الحمض النووي للحصول على شظايا من الحمض النووي بي بي 150-1000، ثم المضي قدما إلى الخطوة 7.4.6. تخرج مواد غير قابلة للذوبان بأقصى سرعة لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. نقل المواد القابلة للذوبان إلى أنبوب جديد. لشركة للملكية الفكرية، قياس تركيز البروتين والشروع في المنسدلة في الخطوة 7، 5. للرقائق، إزالة قاسمة 10 ميليلتر لمسح ليساتي وإضافة IP ميليلتر 40 شطف المخزن المؤقت وميليلتر 6 م 5 كلوريد الصوديوم لأن لما مجموعة 56ul. تغلي لمدة 15 دقيقة عند 95 درجة مئوية وإضافة 5-10 ميليلتر من ناواك م 3 pH 5، وتنظيف في عمود تنقية PCR. قياس تركيز الحمض النووي عن طريق قياس امتصاص في 260 نيوتن متر وتوحيد عبر العينات. ثم انتقل إلى المنسدلة في الخطوة 7، 5.ملاحظة: إضافية يمكن انطباق المجمدة في-80 درجة مئوية واستخدامها في وقت لاحق، ولكن يتم الحصول على نتائج أفضل من الطازجة ليستي. إذا كان التجميد وعدم تجميد/ذوبان الجليد ليستي أكثر من مرة. المنسدلة نقل مبلغ مناسب من البروتين ليستي إلى أنبوب جديد. في حالة استخدام المخزن المؤقت لتحلل فارنهام، تضعف بوحدات التخزين 2.1 من الملكية الفكرية تمييع العازلة (أعلاه). جانبا 100 ميليلتر من المادة طافية لعنصر تحكم الإدخال، وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى اليوم التالي. إضافة حبة/جسم المتقارن من الخطوة 7.3.8 لعينات الآن. تدوير عينات في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها وضمان وجود حجم كاف لحركة السائل في الأنابيب 1.5 مل. أغسل والوتي بعد التناوب بين عشية وضحاها، حفظ المادة طافية الكسر ملزمة. ثم أغسل حبات x 3-5 في المخزن المؤقت لتمييع الملكية الفكرية. إعداد IP شطف العازلة في درجة حرارة الغرفة، دون موانع. الوت المجمعات مع 50 ميليلتر شطف العازلة اهتزت في دوامة في 67 درجة مئوية شطف نقل 15 دقيقة لأنبوب جديد وتكرار مع 50 آخر ميليلتر. الجمع لهم على حد سواء شطف 100 ميليلتر الكامل.ملاحظة: إذا لم يكن هناك الخلفية الكثير من هذا الإجراء شطف، الحرارة يمكن خفض أو القضاء خلال المصافحة بالحضانة. عموما هذا يقلل عائد البروتين المستهدف ولكن إلى حد كبير إنقاص الخلفية. عكس كروسلينكس بتدفئة في 67 درجة مئوية > ح 4.ملاحظة: هذا ليس ضروريا تماما للبرامج المتكاملة المشتركة، لكن يمكن أن تكون مفيدة. لشركة للملكية الفكرية، لضمان ثنائي كامل بين أهداف المصلحة، تشغيل الواتس على جل صفحة الحزب الديمقراطي الصربي والتحقيق مع الأجسام المضادة ضد بطاقة هكتار أو العلامة العلم، كما هو مبين، كل مبلغ 000 1:1. ثم تابع إلى الخطوة رقم 8. لرقاقة–قبكر، لكفالة الترجمة الصحيحة واستهداف لكل مكون من مكونات كريسبر-dCas9، تنظيف المنتج شطف على عمود والوت في 10 ميليلتر. تنفيذ في الوقت الحقيقي الكمية تفاعل البوليميراز المتسلسل (qPCR) لتنقية الحمض النووي. تتوفر الإشعال المستخدمة في عرض البيانات التكميلية الجدول1. ثم تابع إلى الخطوة رقم 8. 8. PCR الكمي واستخراج الحمض النووي الريبي للتحقيق في التغيرات التي يسببها CLOuD9 في التعبير الجيني، أولاً، عزل وتنقية مجموع الجيش الملكي النيبالي من مراقبة الخلية الكريات والكريات خلية ديميريزيد. جعل الحمض النووي التكميلية (كدنا) من الجيش الملكي النيبالي المنقي بالنسخ العكسي17 وإجراء تحليلات qPCR. كبسولة تفجير متوفرة في التكميلية الجدول 1. 9-الكروموسوم تكيف التقاط الإنزيم لمراقبة التغيرات في تواتر الاتصالات الجينوم المكاني الناجم عن CLOuD9، تنفيذ التقاط تكيف كروموسوم (3 ج) فحوصات8. قياس ج 3 ربط المنتجات في مجموعتين من التكرارات لكل من ثلاثة replicates البيولوجية بالكمي PCR الوقت الحقيقي. تطبيع عينات لإشارات ج 3 من محور tubulin. كبسولة تفجير متوفرة في التكميلية الجدول 1.
Representative Results
CLOuD9 يدفع حلقات مركز أبحاث المروج عكسها β-جلوبين. الاستخدام الملائم للنظام CLOuD9 يستحث الاتصال عكسها لوكالة الفضاء الكندية مكملة و CSP CLOuD9 يبني عن طريق إضافة أو إزالة أبا لخلية ثقافة وسائل الإعلام (الشكل 1a). يتم ترجمة وكالة الفضاء الكندية و CSP بنيات (الشكل 1b) إلى مناطق الجينوم المناسبة باستخدام معيار كريسبر جرناس. النظر في الوثائق الهائلة موضع جلوبين البشرية فضلا عن طي الكروموسومات المتكررة وإعادة ترتيب التي تحدث هناك أثناء التطوير، اختيرت هذه المنطقة لإثبات جدوى هذا النظام CLOuD9. بالإضافة إلى ذلك، تم اختيار خط الخلية K562 لأنه قد ثبت على الدوام التعبير عن مستويات عالية من الجين جلوبين γ الجنين، بدلاً من بيتا جلوبين الجينات التي يتم التعبير عنها عادة في الخلايا النسب محمر الكبار صحية. باستخدام الخلايا K562، يمكن فحص قدرة CLOuD9 على تعديل التعبير الجيني محاولة استعادة تعبير الجينات بيتا جلوبين في هذا خط الخلية. قبل تنظيم دورات تعريفية لثنائي، الكروماتين واستخدمت PCR كمي إيمونوبريسيبيتيشن (الرقائق-qPCR) لضمان دقة الترجمة، واستهداف لكل مكون من مكونات CLOuD9 (التكميلية الرقم 1). بالإضافة إلى ذلك، تحققت co-إيمونوبريسيبيتيشن (شركة للملكية الفكرية) مع أو بدون أبا ثنائي وكالة الفضاء الكندية و CSP حضور يجند، فضلا عن إمكانية الرجوع في غياب يجند (الشكل 1 ج و تكميلية الشكل 2). 24 ساعة بعد إضافة أبا، ظهرت اتصال أكبر بين بيتا جلوبين ومركز أبحاث مقاسا كروموسوم تكيف التقاط (3 ج) في الخلايا مع أجزاء ثنائي على حد سواء، ولكن لا عناصر التحكم التي تحتوي على بنيات وكالة الفضاء الكندية أو CSP اثنين فقط، ومن ثم التحقق من صحة خصوصية لتغيير الكروماتين للمواقع المستهدفة (الشكل 1 ج و التكميلية أرقام 3 و 4). إنشاء مركز أبحاث-β-جلوبين التفاعل لا يلغي تماما الاتصال مركز أبحاث-جلوبين الذاتية، ولكن بدلاً من ذلك، إضافة إلى جهة الاتصال الأصلية، كما ذكر سابقا8. ولوحظت زيادات في اتصالات β-جلوبين/مركز أبحاث لمدة تصل إلى 72 ساعة ثنائي، بغض النظر عن المنطقة الدقيقة داخل مركز أبحاث وبيتا جلوبين مروج المنطقة المستهدفة (تكميلية الأرقام 5, 6). وأخيراً، أكدت إمكانية الرجوع للنظام مع ج 3 بعد إزالة أبا، الذي أظهر تجديد كاملة للمطابقة الذاتية (الشكل 1 د و التكميلية الأرقام 3-6). ونحن نعتبر أن نجاح سيظهر في الخلايا K562 قد يكون نتيجة لموقع المكان جلوبين في منطقة يوتشروماتين (الشكل 1 د)، حيث استخدمت خط خلية ثانية لاستكشاف هذه الفكرة. تم تطبيق نظام CLOuD9 HEK 293T الخلايا في المناطق التي هيتيروتشروماتيك، ولا تعبر عن الجينات جلوبين (الشكل 1e). وكانت النتيجة مماثلة لما لوحظ في K562s؛ أكثر الجمعيات مركز أبحاث بيتا جلوبين كانت تقاس ج 3 بعد 24 ساعة مع رابطة المحامين الأمريكية (1e الشكل و التكميلية الرقم 3)، تقديم أدلة لقدرة ل CLOuD9 قوية على وظيفة في مختلف البيئات الخلوية، على الرغم من حالة الكروماتين الأصلي أو المطابقة. تم اختبار المكاني إضافية لضمان انطباق واسع CLOuD9، بما في ذلك المروج Oct4 ومحسن القاصي 5 ‘ داخل الخلايا 293T. سابقا، كان هناك لا تعبير Oct4 يمكن اكتشافها في هذا الخط خلية، وعلاوة على ذلك، أية جهات اتصال الذاتية ووصف. أدلة Oct4 التعبير في الخلايا الجذعية الجنينية الناجمة عن الاتصال مع محسن القاصي 5 ‘ دوافع هذه التجربة، وقد لوحظ نفس النتيجة في موضع بيتا جلوبين18. الاتصال بين Oct4 محسن القاصي والمروج عرف في الخلايا CLOuD9 ممكنة، ولكن لا تحكم الخلايا (الشكل 1f). بالإضافة إلى ذلك، لوحظ أن المروج Oct4 ومحسن تفاعل القاصي 5 ‘المطالبة أيضا محسن 3’ الاتصال بالمروج Oct4. هذا الحدث يتسق مع الأدلة أن محسن 3 ‘يتفاعل مع Oct4 المروج/5’ القاصي محسن معقدة أثناء التنشيط الجيني الذاتية10. CLOuD9 الحث على سياق تعديلات محددة في مواضع الجينات. بعد التأكد من أن النظام CLOuD9 الحث على الفعل الاتصالات كروموسومية في مواضع الجينات، سعينا إلى دراسة تأثير الحلقات في التعبير الجيني. وقد تم توثيق أن النسخ جلوبين والجينات Oct4 لا يتوقف على الاتصالات بين مواضع الجينات مركز أبحاث وجلوبين وبين القاصي 5 ‘ محسن ومروج Oct4، على التوالي1،11. وهكذا، افترضنا أن استخدام CLOuD9 سيؤدي النظام لتشكيل حلقة الكروماتين محرك الأقراص في كل منطقة من هذه المناطق في التعبير الجيني مقنعة. في كلا المكاني، أظهرت RT-qPCR الكروماتين أبا الناجمين عن تلك الحلقات قاد زيادات في التعبير Oct4 في خلايا 293T، وفي تعبير بيتا جلوبين في الخلايا K562، أن لم يكن في 293Ts (الشكل 2a). على الرغم من إضافة أبا خلية ثقافة لقدر ضئيل من 24 بيتا زيادة ح-جلوبين التعبير إلى حد كبير، التعبير استمرت زيادة مطردة تصل إلى 72 ساعة وعكسها على تبييض أبا (الشكل 2a). كافة الخلايا K562 باستثناء عناصر التحكم اتباع هذا الاتجاه، بغض النظر عن أين تقع مكونات ثنائي في مناطق المروج مركز أبحاث وبيتا جلوبين (الشكل 2a و التكميلية أرقام 7، 8). دعما لهذه الاستنتاجات، تقابل qPCR رقاقة الحمض النووي الريبي بول الثاني في محور بيتا جلوبين في K562s و 293Ts و H3K4me3 مع التغييرات الملحوظة في النسخ (الشكل 2 ج-f). CLOuD9 يضع الحلقات الكروماتين مستقرة. ولو اتبعت قصيرة الأجل حلقة تعريفية مع CLOuD9 وضوح التوقعات، سواء توجيهي طويل الأجل من حلقات الآثار التفاضلية ظلت يتعين مراعاتها. لهذا التحقيق، كانت الخلايا المستزرعة حضور أبا لمدة 10 أيام. بينما K562s و 293Ts أظهرت زيادة تواتر الاتصال بين محور بيتا جلوبين وفي مركز أبحاث بالنسبة إلى عناصر التحكم (الشكل 3 أو ب و التكميلية أرقام 9 و 10)، والتعديلات في التعبير بيتا جلوبين لوحظت لا يزال فقط في الخلايا K562 (الشكل 3 ج). من المثير للاهتمام، ومع ذلك، لوحظ الطويلة الأجل أن ثنائي في K562s، حيث كان النسخ بشدة من أوبريجولاتيد، وكان لا عكسها أطول (الشكل 3a و التكميلية الأرقام 9-11). ومع ذلك، في 293Ts، حيث لوحظ لا تغيير في النسخ بعد ثنائي طويل الأجل، الناجم عن التعديلات في الكروماتين الاتصالات ظلت عكسها (الشكل 3b و تكميلية الشكل 9). وبوجه عام، لوحظ فقط انخفاض صغير في التعبير الجيني بعد 10 أيام إزالة أبا، التي ما زالت أعلى بكثير من مستويات التعبير الجيني قبل ثنائي (الشكل 3 ج). وتمشيا مع هذا، خلايا K562، ولكن لا 293T الخلايا، أظهرت تعديلات مستمرة في H3K4me3 والحمض النووي الريبي بول الثاني في محور بيتا جلوبين برقاقة–قبكر، مقارنة بضوابط، حتى بعد 10 أيام إزالة أبا (الشكل 3d-f). وبالتالي، النتائج التي توصلنا إليها تشير إلى أن استقرار حلقة الكروماتين يعني التعبير الجيني مستدامة أكثر. الشكل 1: CLOuD9 يدفع حلقات مركز أبحاث المروج جلوبين β عكسها. (أ) إضافة حمض التسقيط (أبا، الأخضر) يجمع اثنين من ثوابت CLOuD9 التكميلية (CLOuD9 S. المقيّحة (CSP)، المذهبة (CSA) س. CLOuD9، الأحمر والأزرق، على التوالي) في القرب، وإعادة عرض هيكل الكروماتين. إزالة أبا يعيد تشكيل الكروماتين الذاتية. (ب) يبني CLOuD9 تجمع بين التكنولوجيا كريسبر-dCas9 من المذهبة س. و . س. المقيّحة مع المجالات PYL1 و ABI1 ديميريزيابل شكل قابل للعكس. (ج) جدول زمني CLOuD9 ثنائي التجارب. (د) ج 3 الاعتداء بيتا جلوبين قياس crosslinking موقعا على نطاق الترددات في خلايا K562 بعد 24 ساعة علاج مع رابطة المحامين الأمريكية (أحمر) وتبييض اللاحقة (أزرق) تبين إمكانية الرجوع لفعل بيتا-جلوبين/مركز أبحاث الاتصالات (الضوء في الرمادي). رؤوس الأسهم البرتقالية تشير إلى المناطق المستهدفة بناء CLOuD9 محددة. الجزء اكوري التي تحتوي على مواقع لفرط الحساسية 1-4 من مركز أبحاث (شريط أسود) كمنطقة الارتساء. وقيمت التردد crosslinking مع سائر أجزاء اكوري المشار إليه (أسماء أعلى الرسم البياني). أن الجينات البشرية β-جلوبين ومركز أبحاث حساسية المواقع يصور في الجزء السفلي من الرسم البياني مع إحداثيات موضع الكروموسومات. تبين البيانات من الرقائق-seq H3K4me3 و H3K9me3 بأن هذه المنطقة يوتشروماتيك في K562s- (ه) على غرار تعتبر التغييرات عكسها في هيكل الكروماتين في الخلايا HEK 293T، على الرغم من الأدلة المستقاة من البيانات H3K4me3 والرقائق-seq H3K9me3 أن جلوبين المنطقة هيتيروتشروماتيك في هذا النوع من الخلايا. (و) ج 3 المقايسة قياس Oct4 crosslinking موقعا على نطاق الترددات في 293T الخلايا بعد ح 72 المعاملة مع رابطة المحامين الأمريكية (أحمر) عرض الناجم عن اتصالات محسن Oct4/البعيدة (الضوء في الرمادي). رؤوس الأسهم البرتقالية تشير إلى المناطق المستهدفة بناء CLOuD9 محددة. الجزء مبوي تحتوي على مروج Oct4 (شريط أسود) كمنطقة الارتساء. وقيمت التردد crosslinking مع أخرى أجزاء مبوي المشار إليه (أسماء أعلى الرسم البياني). هي صورت مناطق Oct4 البشرية في الجزء السفلي من الرسم البياني مع إحداثيات موضع الكروموسومات. وتم الحصول على جميع النتائج ج 3 من التجارب المستقلة ثلاثة على الأقل. تم تطبيع القيم ج 3 إلى توبولين. ل β-جلوبين، تم تعيين ترددات التفاعل بين الجزء مذيع والجزء يشمل الجزء بيتا/النظام المنسق لصفر. ل Oct4، تم تعيين ترددات التفاعل بين الجزء مذيع وجزء مراقبة سلبية خارج منطقة التفاعل Oct4 إلى الصفر. أشرطة الخطأ الإشارة إلى المرسوم العالي n = 3. تم تعديل هذا الرقم من الرقم 1 في مورغان، لام ستيفاني, et al. 9- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 2: CLOuD9 الحث على سياق تعديلات محددة في الدولة الكروماتين والتعبير الجيني. (أ) CLOuD9 المستحثة الكروماتين حلقات في النتائج موضع بيتا جلوبين في استحثاث عكسها التعبير بيتا جلوبين في K562s ولكن ليس في 293Ts-أهمية النظر بالنسبة إلى مراقبة تعامل الخلايا. التائي t-اختبارات * P < 0.05، t = 3.418، مدافع = 5؛ ف < 0.0001، t = 10.42 مدافع = 5؛ نوفاسكوتيا غير هامة. أشرطة الخطأ الإشارة إلى المرسوم العالي n = 3. (ب) حلقات التعريفي Oct4 التعبير ولوحظ في أعقاب 293Ts المستحثة CLOuD9 في المكان نفسه. وتعطي أهمية بالنسبة إلى مراقبة تعامل الخلايا. التائي t-اختبارات * P < 0.05، t = 4.562، مدافع = 2. أشرطة الخطأ الإشارة إلى المرسوم العالي (ج) التخطيطي qPCR رقاقة التمهيدي المواقع على طول الجسم مورثة بيتا جلوبين. (د، ه) رقاقة قبكر يوضح التعديلات عكسها في H3K4me3 في موضع بيتا جلوبين في K562s ولكن ليس في 293Ts عقب المستحثة CLOuD9 حلقات. التائي t-اختبارات * P < 0.05، * * ف < 0.001، * * * ف < 0.0001. أشرطة الخطأ الإشارة إلى المرسوم العالي (و) CLOuD9 وساطة التعديلات في النسخ بيتا جلوبين في K562s تتطابق مع الزيادات في شغل الجيش الملكي النيبالي بول الثاني عبر كامل الجسم مورثة بيتا جلوبين. التائي t-اختبارات * P < 0.05، * * ف < 0.001، * * * ف < 0.0001. أشرطة الخطأ تشير إلى التنمية المستدامة لقد تم تعديل هذا الرقم من الرقم 2 في مورغان، ستيفاني L.، وآخرون. 9- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 3: CLOuD9 يضع الحلقات الكروماتين المستقرة التي تغذي التعبير الجيني قوية عقب ثنائي طويل الأجل. (أ، ب) مقايسة ج 3 يوضح أن في K562s ولكن لا 293Ts، الكروماتين CLOuD9 المستحثة حلقات انتكاس بعد 10 أيام علاج أبا، حتى عندما تتم إزالة أبا لمدة تصل إلى 10 أيام إضافية. جميع 3 ج تم الحصول على نتائج من تجارب مستقلة على الأقل ثلاثة. تم تطبيع القيم ج 3 إلى توبولين، وتم تعيين ترددات التفاعل بين الجزء مذيع والجزء يشمل الجزء بيتا/النظام المنسق إلى الصفر. أشرطة الخطأ الإشارة إلى المرسوم العالي n = 3. (ج) نتائج حلقة الاستقرار في K562s في التعبير المستمرة من β-جلوبين، حتى بعد 10 أيام تبييض أبا. ولوحظت أية تغييرات في التعبير بيتا جلوبين في 293Ts-أهمية النظر بالنسبة إلى مراقبة تعامل الخلايا. التائي t-الاختبارات * * * ف < 0.0001، t = 5.963، مدافع = 5؛ استدامة نوفاسكوتيا إظهار غير الهامة (د) رقاقة qPCR الزيادات في علامات H3K4me3 على محور بيتا جلوبين ردا على فعل CLOuD9 حلقات بعد 10 أيام تبييض يجند في K562s–التائي t-اختبارات * ف < 0.05، * * P < 0.001، * * * ف < 0.0001. (ه) لا تغييرات كبيرة في H3K4me3 الإشارات التالية طويلة الأجل لوحظت ثنائي برقاقة–قبكر 293Ts- (و) زيادة الحمض النووي الريبي بول-ثانيا شغل المكان بيتا جلوبين أثر طويل الأجل حلقة تعريفية واستمر في K562s بعد 10 أيام من يجند تبييض. التائي t-اختبارات * P < 0.05، * * ف < 0.001، * * * ف < 0.0001. وتشير كافة أشرطة الخطأ إلى المرسوم العالي لقد تم تعديل هذا الرقم من الرقم 3 في مورغان، ستيفاني L.، وآخرون. 9- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- التكميلية الرقم 1: CLOuD9 بنيات المعربة إلى مناطقها الهدف المقصود. إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين والكمي PCR CLOuD9 ثوابت تثبت التعريب الصحيح المكاني الجينوم المقصود بهم. لقد تم تعديل هذا الرقم من التكميلية الرقم 1 في مورغان، ستيفاني L.، وآخرون. 9- اضغط هنا لتحميل هذا الرقم- التكميلية الرقم 2: CLOuD9 بنيات إقران عكسية في الاستجابة للعلاج أبا. Co-إيمونوبريسيبيتيشنز مما يدل على رابطة البروتينات dCas9 ح 72 التالية من العلاج أبا عكس التالية اللاحقة ح 72 من يجند تبييض. لقد تم تعديل هذا الرقم من التكميلية الرقم 2 في مورغان، ستيفاني L.، وآخرون. 9- اضغط هنا لتحميل هذا الرقم- التكميلية الرقم 3: معاملة السيطرة يدفع لا تغييرات في اتصالات الكروماتين. المعاملة مع [دمس]، عامل، ومراقبة لمدة 24 ساعة يدفع لا تغييرات في تشكيل الكروماتين الذاتية التي ج 3 في الخلايا K562 أما أو تم تطبيع HEK 293Ts. ج 3 قيم tubulin، وترددات التفاعل بين الجزء مذيع والجزء يشمل الجزء بيتا/HS تم تعيين إلى صفر. أشرطة الخطأ تشير إلى التنمية المستدامة. n = 3. لقد تم تعديل هذا الرقم من التكميلية الرقم 3 في مورغان، ستيفاني L.، وآخرون. 9- اضغط هنا لتحميل هذا الرقم- التكميلية الرقم 4: CLOuD9 التحكم ترانسدوسيد الخلايا إظهار أي تعديلات في حلقات الكروماتين. توجيه اثنين CLOuD9 بنيات أما في مركز أبحاث أو المروج بيتا جلوبين يدفع لا تغييرات هامة في هيكل الكروماتين ج 3 بعد المعالجة أبا مقارنة بمعاملة السيطرة. تم تطبيع القيم ج 3 إلى توبولين، وتم تعيين ترددات التفاعل بين الجزء مذيع والجزء يشمل الجزء بيتا/النظام المنسق إلى الصفر. أشرطة الخطأ تشير إلى التنمية المستدامة. n = 3. لقد تم تعديل هذا الرقم من التكميلية الرقم 4 في مورغان، ستيفاني L.، وآخرون. 9- اضغط هنا لتحميل هذا الرقم- التكميلية الرقم 5: CLOuD9 الكروماتين حلقات لا تزال عكسها بعد 72 ساعة ثنائي- يوضح التحليل ج 3 في K562s فعل عكس CLOuD9 β-جلوبين/مركز أبحاث الاتصالات بعد 72 ساعة علاج أبا. تم تطبيع القيم ج 3 إلى توبولين، وتم تعيين ترددات التفاعل بين الجزء مذيع والجزء يشمل الجزء بيتا/النظام المنسق إلى الصفر. أشرطة الخطأ تشير إلى التنمية المستدامة. n = 3. لقد تم تعديل هذا الرقم من التكميلية الرقم 5 في مورغان، ستيفاني L.، وآخرون. 9- اضغط هنا لتحميل هذا الرقم- التكميلية الرقم 6: CLOuD9 حلقات β-جلوبين/مركز أبحاث المستحث هو لا تتأثر بالموقع المستهدف جلوبين. توجيه وكالة الفضاء الكندية و CSP بنيات إلى مناطق بديلة في مركز أبحاث أو نتائج المروج بيتا جلوبين في تغييرات مماثلة عكسها في حلقة تعريفية ج 3 بعد 72 ساعة علاج أبا. تم تطبيع القيم ج 3 إلى توبولين، وتم تعيين ترددات التفاعل بين الجزء مذيع والجزء يشمل الجزء بيتا/النظام المنسق إلى الصفر. أشرطة الخطأ تشير إلى التنمية المستدامة. n = 3. لقد تم تعديل هذا الرقم من التكميلية الرقم 6 في مورغان، ستيفاني L.، وآخرون. 9- اضغط هنا لتحميل هذا الرقم- التكميلية الرقم 7: CLOuD9 التغييرات المستحثة في التعبير الجيني هي مستمرة بغض النظر عن الموقع المستهدف جلوبين. توجيه وكالة الفضاء الكندية و CSP بنيات إلى مناطق بديلة في المروج بيتا جلوبين ومركز أبحاث ليس له أي تأثير على تحريض التعبير الجيني بعد 72 ساعة ثنائي. لكن بينما بعض تأثير قوة التعبير الجيني لوحظ ثنائي طويل الأجل (يوم 10) التالية، كانت مستويات عالية من بيتا-جلوبين بالنسبة إلى مراقبة تعامل الخلايا المطرد تبييض يجند اللاحقة التالية لمدة 10 أيام إضافية. وتعطي أهمية بالنسبة إلى مراقبة تعامل الخلايا. ف < 0.001، t = 10.25، مدافع = 5؛ ف < 0.0001، يترك للحق t = 8.697، مدافع = 6، t = 40.31، مدافع = 7؛ نوفاسكوتيا غير هامة. وتشير كافة أشرطة الخطأ إلى التنمية المستدامة. لقد تم تعديل هذا الرقم من التكميلية الرقم 7 في مورغان، ستيفاني L.، وآخرون. 9- اضغط هنا لتحميل هذا الرقم- التكميلية الرقم 8: CLOuD9 التحكم ترانسدوسيد الخلايا إظهار أي تعديلات في التعبير بيتا جلوبين. توجيه اثنين CLOuD9 بنيات أما في مركز أبحاث أو المروج بيتا جلوبين يدفع أي تغيرات هامة في التعبير بيتا جلوبين بعد المعالجة أبا مقارنة بمعاملة السيطرة. وتعطي أهمية بالنسبة إلى مراقبة تعامل الخلايا. نوفاسكوتيا غير هامة. لقد تم تعديل هذا الرقم من التكميلية الرقم 8 في مورغان، ستيفاني L.، وآخرون. 9- اضغط هنا لتحميل هذا الرقم- التكميلية الرقم 9: يدفع علاج طويل الأمد بمراقبة لا تغييرات في اتصالات الكروماتين. يدفع المعاملة مع [دمس]، عامل تحكم، لمدة 10 أيام أي تغيير في تشكيل الكروماتين الذاتية التي ج 3 في الخلايا K562 أما أو تم تطبيع HEK 293Ts. ج 3 قيم tubulin، وترددات التفاعل بين الجزء مذيع والجزء يشمل الجزء بيتا/HS تم تعيين إلى صفر. أشرطة الخطأ تشير إلى التنمية المستدامة. n = 3. لقد تم تعديل هذا الرقم من التكميلية الرقم 9 في مورغان، ستيفاني L.، وآخرون. 9- اضغط هنا لتحميل هذا الرقم- التكميلية الرقم 10: CLOuD9 الطويلة الأجل حلقات β-جلوبين/مركز أبحاث المستحث هو لا تتأثر بالموقع المستهدف جلوبين. توجيه وكالة الفضاء الكندية و CSP بنيات إلى مناطق بديلة مركز أبحاث أو نتائج المروج بيتا جلوبين في المثل تستمر حلقة تعريفية كما يتبين من ج 3 بعد 10 أيام من العلاج أبا و 10 أيام ليجند اللاحقة تبييض. تم تطبيع القيم ج 3 إلى توبولين، وتم تعيين ترددات التفاعل بين الجزء مذيع والجزء يشمل الجزء بيتا/النظام المنسق إلى الصفر. أشرطة الخطأ تشير إلى التنمية المستدامة. n = 3. لقد تم تعديل هذا الرقم من التكميلية الرقم 10 في مورغان، ستيفاني L.، وآخرون. 9- اضغط هنا لتحميل هذا الرقم- التكميلية الرقم 11: CLOuD9 بنيات المنتسبين لا رجعة فيه استجابة لعلاج طويل الأجل أبا. Co-إيمونوبريسيبيتيشنز مما يدل على الرابطة لا رجعة فيه من وكالة الفضاء الكندية و CSP البروتينات dCas9 بعد 10 أيام علاج أبا وعشرة أيام لاحقة ليجند تبييض. لقد تم تعديل هذا الرقم من التكميلية الرقم 11 في مورغان، ستيفاني L.، وآخرون. 9- اضغط هنا لتحميل هذا الرقم- التكميلية الجدول 1: قائمة بالتمهيدي تسلسل جرناس بكر qRT، ج 3 ورقاقه qPCR. لقد تم تعديل هذا الجدول من التكميلية الجدول 1 في مورغان، ستيفاني L.، وآخرون. 9- الرجاء اضغط هنا لتحميل هذا الجدول
Discussion
The most خطوات حاسمة في حلقات الكروماتين CLOuD9: 1) تصميم أو استخدام جرناس الصحيح، الإعلام 2) المتغيرة يوميا على ترانسدوسيد CLOuD9 الخلايا، بما في ذلك أبا أو [دمس]، 3) الحفاظ على نضارة أبا، و 4) إجراء تقييمات دقيقة ومتأنية من الكروماتين المطابقة.
حدود CLOuD9 يقيمون أساسا في القدرة على تصميم أدلة للمنطقة المستهدفة للاختيار. دليل الكشف القيام بالمهمة الهامة المتمثلة في إضفاء الطابع المحلي على مكونات dCas9 إلى المناطق المستهدفة الحمض النووي تكون ديميريزيد وفعالية الأدلة تستند إلى موقعهم مستهدفة محددة. دون المكونات جرنة السليم، CLOuD9 النظام لن يكون قادراً على تشكيل عكسية الناجمين عن الحلقات. وهكذا، بتصميم أدلة متعددة لكل منطقة من مناطق الاهتمام ونشر الأدلة على منطقة 250-1000 bp، سيكفل دليل نجاح واحد على الأقل. موقع الدليل أيضا جزء لا يتجزأ من نتائج دقيقة. من المهم تجنب الأدلة الموجودة في مواقع الربط عامل النسخ أو المناطق الحرجة الأخرى لمنع الآثار الخلفية مثل أعلى أو أسفل اللائحة من النسخ. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تؤثر الموقع الدقيق لبناء CLOuD9 قليلاً بنسخ الجينات المستهدفة. وهذا يؤكد أهمية اختبار أزواج متعددة من الأدلة لكل المنطقة المستهدفة، وتحديد الزوج الأكثر قوة لأغراض تجريبية. علاوة على ذلك، في كل زوج من المناطق المستهدفة، ينبغي أن تستهدف بناء وكالة الفضاء الكندية مع جرناس ل S. aureus، وينبغي أن تستهدف بناء CSP مع جرناس المقيّحة س لاستهداف خصوصية.
لضمان دقة النتائج وثنائي الصحيح، من المهم أيضا للحفاظ على نضارة البيئات الخلوية بعد توصيل من بنيات CLOuD9. تغيير وسائل الإعلام اليومية وإضافة ديميريزير جديدة (أو التحكم) يضمن أن تظل بالقرب من بنيات مكملة والحفاظ على تكيف الكروماتين غيرت. وعلاوة على ذلك، تضمن أبا طازجة وتم تخزينها على نحو مناسب وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة (فتح في غضون 6 أشهر، تبقى باردة، محمية من الضوء) ضروري للحصول على نتائج صحيحة.
جدير بالذكر أن استخدمت ديميريزير أبا ل CLOuD9 مع أبي وبرونتوسوروس البروتينات ثنائي، بدلاً من أن تستخدم الأكثر شيوعاً نظام FRB وفكبب. ضرورة رابالوج للنظام FRB/فكبب ستكون محدودة بانطباق CLOuD9، بسبب السمية على الخلايا السرطانية. التحايل نظام بديل لأبي/برونتوسوروس هذا القيد، فعالية تمكين CLOuD9 أن يكون قابل للاستعمال على نطاق أوسع.
جماعياً، وقد وضعنا CLOuD9، تقنية فريدة وقوية يمكن قسراً ولكن عكسية إنشاء جهات اتصال بين الهدف بعيد المدى المكاني الجينوم. من خلال حمل الحلقات الكروماتين، نثبت أيضا أن CLOuD9 يمكن أن تستخدم لتعديل التعبير الجيني في سياق الخلوية المناسبة. يسمح تكييف التكنولوجيا لدراسة التفاعلات بين أي المكاني الجينوم اثنين، دون أن يتطلب ذلك معرفة مسبقة من حلقات المناطق أو حلقات الآليات غير مقيد. وباﻹضافة إلى ذلك، عكس CLOuD9 بأظهر فريدة من نوعها تمكن كذلك دراسة آليات حلقات في المرض والتنمية. في حين آثار على الهدف من حلقات الكروماتين قد تم بوضوح، هناك بعد أن تكون البيانات التي توفر نظرة ثاقبة آثار حلقات خارج الهدف والأثر اللاحق على الحلقات على الهدف.
لدينا البيانات يوضح سوى عدد قليل من الطلبات لهذه الأداة ولكن يعني الفكرة الأساسية الرئيسية أن ترتيب الكروماتين إرشادي للتعبير الجيني. يمكن استخدام التكنولوجيا لدينا لدراسة وتكشف عن الفروق الدقيقة هيكل الكروماتين في تنظيم الجينات، مما يؤدي إلى تحسين الفهم العام لدور الكروماتين قابلة للطي في نسخ جينات. فهم أفضل للدقيقة لديناميات النسخي يمكن أن تقود الطريق في البحوث والعلاج من السرطان والأمراض الوراثية والخلقية، في الكروماتين المتميزة التي يغير الجمعية بلا شك التعبير الجيني20، 21،،من2223. سوف تضيء الأعمال اللاحقة استخدام تكنولوجيا CLOuD9 المزيد من التفاصيل حول الترتيب وديناميات المجالات الكروماتين وكيف أنها محرك أقراص قابلة للطي للحفاظ على التعبير الجيني مستقرة في كل من التنمية والمرض.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر تشانغ حاء، أورو ت.، س. تافازوي، فلين R.، باتيستا ص، كالو هاء، ومختبر وانغ كامل الدعم الفني وقراءة نقدية من المخطوطة. وقد دعمت S.L.M. في هذا العمل عن طريق نسفجرف (DGE-114747)، ندسيجف (FA9550-11-ج-0028)، والمعهد الوطني للسرطان (1F99CA222541-01). K.C.W. معتمد من قبل “جائزة المهنة” “علماء الطب” من صندوق ويلكوم بوروز، وهو دونالد هاء ودليا باء باكستر مؤسسة كلية الباحث.
Materials
| RPMI 1640 media | Life Technologies | 11875-119 | For K562 cell culture |
| DMEM media | Life Technologies | 11995-065 | 1X, for 293T cell culture |
| lentiCRISPR v2 | Addgene plasmid | #52961 | For CLOuD9 plasmid development |
| pRSV-Rev | Addgene plasmid | #12253 | For lentivirus production |
| pMD2.G | Addgene plasmid | #12259 | For lentivirus production |
| pMDLg/pRRE | Addgene plasmid | #12251 | For lentivirus production |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668-019 | For lentivirus production |
| anti-HA antibody | Cell Signaling | 3724 | For immunoprecipitation |
| anti-Flag antibody | Sigma | F1804 | For immunoprecipitation |
| DNeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For DNA extraction |
| TRIzol | Life Technologies | 15596-018 | For RNA extraction |
| RNeasy Kit | Qiagen | 74106 | For RNA extraction |
| Superscript VILO | Life Technologies | 11754-050 | For cDNA |
| SYBR Green I MasterMix | Roche | 4707516001 | For qPCR analysis |
| Light Cycler 480II | Roche | For qPCR analysis | |
| anti-H3K4me3 antibody | AbCam | ab8580 | For ChIP-qPCR |
| anti-RNA Pol-II antibody | Active Motif | 61083 | For ChIP-qPCR |
| EDTA free protease inhibitor | Roche | 11873580001 | For protein extraction |
| 4-12% Tris Glycine gel | Biorad | Any size, For western blot | |
| anti-Rabbit HRP antibody | Santa Cruz | sc-2030 | For western blot |
| anti-mouse HRP antibody | Cell Signaling | 7076S | For western blot |
| K562 and H3K293 ChIP-Seq data | Encode | ENCSR000AKU | For ChIP-seq analysis |
| K562 and H3K293 ChIP-Seq data | Encode | ENCSR000APE | For ChIP-seq analysis |
| K562 and H3K293 ChIP-Seq data | Encode | ENCSR000FCJ | For ChIP-seq analysis |
| K562 and H3K293 ChIP-Seq data | GEO | GSM1479215 | For ChIP-seq analysis |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Thermo Fisher Scientific | 10001D | For immunoprecipitation |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Thermo Fisher Scientific | 10004D | For immunoprecipitation |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | For RNA purification |
| Pierce 16% Formaldehyde Methanol-free | Thermo Fisher Scientific | 28908 | For crosslinking |
| PX458 Plasmid | Addgene | 48138 | Suggested active Cas9 plasmid for gRNA cloning, but any active Cas9 plasmid will do |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | For PCR purification |
| FastDigest BsmBI | Thermo Fisher Scientific | FD0454 | For cloning guide RNAs |
| FastAP | Thermo Fisher Scientific | EF0651 | For cloning guide RNAs |
| 10X FastDigest Buffer | Thermo Fisher Scientific | B64 | For cloning guide RNAs |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For cloning guide RNAs |
| 10X T4 Ligation Buffer | NEB | B0202S | For cloning guide RNAs |
| T4 PNK | NEB | M0201S | For cloning guide RNAs |
| 2X Quick Ligase Buffer | NEB | B2200S | For cloning guide RNAs |
| Quick Ligase | NEB | M2200S | For cloning guide RNAs |
| Buffers | |||
| Farnham lysis buffer | 1% Tris-Cl pH 8.0, 1% SDS, 1% protease inhibitor water solution (non-EDTA), and 1 mM EDTA in water | ||
| Modified RIPA buffer | 1% NP40/Igepal, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, and 1% protease inhibitor water solution (non-EDTA) in PBS pH 7.8 or 7.4 | ||
| IP dilution buffer | 0.01% SDS, 1.1% Triton-X 100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris-HCl pH 8.0, 167 mM NaCl, 0.1x protease inhibitor | ||
| Wash buffer | 100 mM Tris pH 9, 100 mM LiCl, 1% NP-40, and 1% sodium deoxycholate | ||
| Swelling buffer | 0.1 M Tris pH 7.5, 10 mM potassium acetate, 15 mM magnesium acetate, 1% NP-40 | ||
| Dilution buffer | 0.01% SDS, 1.1% Triton X-100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris pH 8 and 167 mM NaCl | ||
| IP elution buffer | 1% SDS, 10% NaHCO3 |
References
- Krivega, I., Dean, A. Chromatin looping as a target for altering erythroid gene expression. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1368, 31-39 (2016).
- Matharu, N., Ahituv, N. Minor loops in major folds: Enhancer-promoter looping, chromatin restructuring, and their association with transcriptional regulation and disease. PLoS Genet. 11, e1005640 (2015).
- Dekker, J., Martí-Renom, M. A., Mirny, L. A. Exploring the three-dimensional organization of genomes: interpreting chromatin interaction data. Nat. Rev Genet. 14, 390-403 (2013).
- Kim, A., Dean, A. Chromatin loop formation in the b-globin locus and its role in globin gene transcription. Mol Cells. 34, 1-5 (2012).
- Petrascheck, M., et al. DNA looping induced by a transcriptional enhancer in vivo. Nucleic Acids Res. 33, 3743-3750 (2005).
- Ameres, S. L., et al. Inducible DNA-loop formation blocks transcriptional activation by an SV40 enhancer. EMBO J. 24, 358-367 (2005).
- Deng, W., et al. Controlling Long-Range Genomic Interactions at a Native Locus by Targeted Tethering of a Looping Factor. Cell. 149, 1233-1244 (2012).
- Deng, W., et al. Reactivation of developmentally silenced globin genes by forced chromatin looping. Cell. 158, 849-860 (2014).
- Morgan, S. L., et al. Manipulation of Nuclear Architecture through CRISPR-Mediated Chromosomal Looping. Nature Communications. 8, (2017).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17 (1), 148 (2016).
- . . Lipofectamine 2000 Reagent. , (2013).
- . . DNeasy Blood & Tissue Kit Handbook. , (2006).
- . . Determining Genome Targeting Efficiency using T7 Endonuclase I (M0302). , (2016).
- Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods Mol Biol. 649, 247-256 (2010).
- Shalem, O., Sanjana, N. E., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. , 83-87 (2014).
- . . RNeasy Mini Handbook. , (2012).
- . . SuperScript VILO cDNA Synthesis Product Information Sheet. , (2015).
- Theunissen, T. W., et al. Systematic identification of culture conditions for induction and maintenance of naive human pluripotency. Cell Stem Cell. 15, 471-487 (2014).
- Mokry, M., et al. Integrated genome-wide analysis of transcription factor occupancy, RNA polymerase II binding and steady state RNA levels identify differentially regulated functional gene classes. Nucleic Acids Res. 40, 148-158 (2012).
- Drier, Y., et al. An oncogenic MYB feedback loop drives alternate cell fates in adenoid cystic carcinoma. Nat Genet. 48, 265-272 (2016).
- Ryan, R. J. H., et al. Detection of enhancer-associated rearrangements reveals mechanisms of oncogene dysregulation in B-cell lymphoma. Cancer Discov. 5, 1058-1071 (2015).
- Montavon, T., et al. A regulatory archipelago controls Hox genes transcription in digits. Cell. 147, 1132-1145 (2011).
- Lupianez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161, 1012-1025 (2015).
Cite This Article
Morgan, S. L., Chang, E. Y., Mariano, N. C., Bermudez, A., Arruda, N. L., Wu, F., Luo, Y., Shankar, G., Huynh, S. K., Huang, C., Pitteri, S. J., Wang, K. C. CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure. J. Vis. Exp. (139), e57457, doi:10.3791/57457 (2018).