Kromatin döngü gen düzenlemesi içinde önemli bir rol oynar; Ancak, kromatin döngüler seçici ve tersinir değişikliği için izin hiçbir teknolojik gelişmeler olmuştur. Burada biz kromatin döngü yeniden yapılanma için güçlü bir sistemi tarif CRISPR-dCas9 (CLOuD9), seçmeli olarak ve geri dönülebilir olarak gen ekspresyonu, modüle gösterdi kullanarak hedef loci.
Son çalışmalar açıkça etkileşimleri oyun ama döngü sorumlu olup veya gen ifadesinde değişiklikler sonucu Gen ifadesinin düzenlenmesinde önemli rol hala döngü bu uzun menzilli, üç boyutlu kromatin göstermiştir bilinmeyen. Yakın zamana kadar gen etkinliğini ve hücresel fonksiyon Yönetmeliği etkilemesi kromatin döngü görece belirsiz oldu ve sınırlamalar bu yapıların işlemek için varolan yöntemleri bu etkileşimler derinlemesine incelenmesi engelledi. Bu belirsizlik gidermek için biz bir yöntem seçici ve tersinir kromatin döngü yeniden yapılanma için mühendislik CRISPR-dCas9 (CLOuD9) kullanarak. Dinamizm CLOuD9 sisteminin CLOuD9 yapıları yerel kromatin conformation modüle genomik loci hedeflemek için başarılı yerelleştirme tarafından kanıtlanmıştır. Önemlisi, indüklenen ilgili ters ve endojen kromatin uyum geri yükleme olanağı da doğrulanmıştır. Bu yöntemle Gen ifadesinin modülasyon hücresel gen ekspresyonu düzenleyecek kapasitesi kurar ve istikrarlı de novo belirgin gen etkiler kromatin döngüler oluştururken bu teknolojinin uygulamalar için büyük bir potansiyel altını çiziyor kanser ve geliştirme bağlamlarda ifadesi.
Gen ifade1,2ile yakından ilişkili olduğu gösterilmiştir gibi çekirdek ve belirli genom organizasyonu katlama kromatin arasındaki ilişki son yıllarda önemli ilgi topladı vardır. Gen etkinliğini ve modülasyon kromatin yapısının kesin ilişkisi belirsiz durumda olduğu sürece, bu dinamik üç boyutlu kromatin organizasyon sonucunda kromozom kişiler arasındaki etkileşimler hizmet onaylanmadığına karar bir gen düzenleyici fonksiyonu3. Gerçekten de, böyle bir etkisi de nerede odağı kontrol bölgesi (LCR) etkinliği globin genleri ile gelişimsel olarak belirli bir şekilde kromatin döngü arasında iki bölgeden4oluşturarak düzenleyen insan globin gen odağı, kanıtlanmıştır. Ancak, hem bu ve diğer bölgelerde, bu kromatin döngü bir neden ya da Gen ifadesinin içinde değişiklikler sonucu olup olmadığı belli değildir.
Şimdiye kadar bu olay eğitim sorunlar çözümsüz. Örneğin, kromatin döngüler inducing diğer girişimleri doğrusal DNA dizisi veya arka plan bilgisi döngü5,6kolaylaştırmak belirli öğeler üzerinde çok miktarda gerektiren karmaşık prosedürler değiştirme dahil, 7,8. Ayrıca, önceki çalışma o kromatin sürücü gen ekspresyonu belirli ve sınırlı içerik7,döngüler önerdi iken8, hangi kromatin döngü transkripsiyon küresel etkiler düzeyi belirsizdir. Uzun menzilli gen ekspresyonu üzerinde döngü etkisini ilgi sürekli son yıl içinde büyüdü rağmen kurulması ve gen etkinliği değiştirmek için Kromatin kişiler istinat hakkında cevapsız sorular devam etmektedir.
Biz si mühendislik teknolojisi nükleaz eksik kümelenmiş ilişkili düzenli olarak interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) – CRISPR – protein 9 (dCas9), genel olarak uygulanabilir herhangi bir genomik loci9/ hedefleme için izin vermek için kullanır. Bu teknoloji doğrusal DNA dizisi değişiklikler ile ilgili karmaşık sorunları ortadan kaldırır ve belirli döngü bileşenlerinin önemli ön bilgi olmadan erişilemez. En önemlisi, evrensel ve geniş olduğu gibi hastalıklar, kanser gibi çeşitli geliştirme de tanınan kromatin döngüler için geçerli bir araçtır. CLOuD9 gücünü geri dönülebilir olarak etkili bir şekilde gen ekspresyonu modüle döngüler yapısını değiştirerek gösterilmiştir.
The Most CLOuD9 kromatin döngü kritik adım vardır: 1) tasarlama veya doğru gRNAs kullanarak, ABA veya DMSO, dahil olmak üzere günlük CLOuD9 transduced hücrelerde, 2) değişen medya 3) ABA tazeliğini korumak ve 4) doğru ve dikkatli değerlendirme gerçekleştirme Kromatin biçimi.
CLOuD9 sınırlarını öncelikle hedef bölgeyi tercih kılavuzları tasarım yeteneği bulunur. Kılavuzu RNA’ların dCas9 bileşenleri dimerized için hedef DNA bölgelerine yerelleştirme önemli görevi gerçekleştirmek ve kılavuzları etkinliğini belirli hedef sitede temel alır. Uygun gRNA bileşenleri sistem geri dönülebilir olarak oluşturmak mümkün olmayacaktır CLOuD9 döngüler indüklenen. Böylece, ilgi her bölge için birden çok kılavuzları tasarlama ve kılavuzları 250-1000 bp bir bölge üzerinde yayılıyor, en az bir başarılı Kılavuzu sağlanacak. Kılavuzu konumu da doğru sonuçlar için ayrılmaz bir parçasıdır. Arka plan efektleri gibi yukarı veya aşağı transkripsiyon önlemek için kılavuzları transkripsiyon faktörü bağlayıcı siteleri veya diğer kritik bölgelerde bulunan önlemek önemlidir. Ayrıca, CLOuD9 yapýsý tam yerini biraz hedef Gen transkripsiyonu etkileyebilir. Bu kılavuzların her hedef bölgenin en güçlü çifti için Deneysel amaçlar tanımlamak için birden çok ikili test önemini vurgular. Ayrıca, her çifti hedef bölgeleri, CSA yapı gRNAs ile S. aureusiçin hedef olmalıdır ve CSP yapı gRNAs ile S. pyogenes için özgüllük hedefleme için hedef olmalıdır.
Doğru sonuçlar ve doğru dimerization emin olmak için bu da CLOuD9 yapıları, iletim takip hücresel ortamlar tazeliğini korumak önemlidir. Günlük medya değiştirmek ve taze dimerizer (veya kontrol) eklenmesi tamamlayıcı yapıları yakınlık içinde kalır ve değiştirilmiş kromatin biçimi korumak sağlar. Ayrıca, ABA taze ve uygun şekilde (6 ay, soğuk, ışıktan korunan muhafaza açılır) üreticinin protokolüne göre depolanan garanti otantik sonuçları elde etmek için esastır.
Özellikle, daha yaygın olarak kullanılan FRB ve FKBP sistemi yerine CLOuD9 ABA dimerizer ABI ve PYL dimerization proteinler ile kullanıldı. Bir rapalog gerekliliği FRB/FKBP sistemi için CLOuD9, uygulanabilirliği için kanser hücrelerinin zehirlenmesi nedeniyle sınırlı. Alternatif ABI/PYL sistemi etkili bir şekilde daha geniş kullanılabilecek olmak CLOuD9 etkinleştirme bu sınırlama hile.
Topluca, biz CLOuD9, zorla ama geri dönülebilir olarak kişiler arasında uzun menzilli hedef genomik loci oluşturmak benzersiz ve güçlü bir teknoloji geliştirdik. Kromatin döngüler inducing aracılığıyla, biz de CLOuD9 gen ekspresyonu uygun hücresel bağlamda değiştirmek için kullanılması gereken göstermek. Sınırsız çalışma bölgeleri döngüye veya mekanizmaları döngü ile ön bilgi gerek kalmadan herhangi bir iki genomik loci arasındaki etkileşimler için teknolojiye uyum sağlar. Buna ek olarak, CLOuD9’ın benzersiz gösterdiği reversibility daha fazla döngü mekanizmaları incelenmesi hastalık ve geliştirme sağlar. Kromatin döngü hedef üzerinde etkilerini açıkça göstermiştir, orada iken henüz hedef üzerinde döngüler hedef kapalı döngü ve sonraki etkisi etkileri içgörü sunan veri olmak.
Bizim veri bu araç sadece birkaç uygulamaları göstermektedir ancak kromatin düzenleme gen ifadesi göstergesidir büyük temel fikir anlamına gelir. Bizim teknoloji çalışma ve gen düzenlemesi, böylece genlerin transkripsiyon katlama kromatin rolü genel anlayışı artırma kromatin yapısında nüansları ortaya çıkarmak için kullanılabilir. Transkripsiyon dynamics inceliklerini daha iyi anlaşılmasını araştırma ve tedavi kanser, kalıtsal hastalıklar ve konjenital bozukluklar, hangi farklı kromatin derleme şüphesiz gen ifade20değiştirir şekilde yol açabilir, 21,22,23. Sonraki çalışma CLOuD9 teknoloji kullanarak daha fazla düzenleme ve kromatin etki alanları ve nasıl onlar istikrarlı gen ekspresyonu geliştirme ve hastalık sürdürebilmek için katlama sürücü dinamiklerini ayrıntılarını yanacaktır.
The authors have nothing to disclose.
H. Chang, T. Oro, S. Tavazoie, R. Flynn, P. Batista, E. Calo ve tüm Wang laboratuvar teknik destek ve makalenin eleştirel okuma için teşekkür ederiz. S.L.M. NSFGRF (DGE-114747), NDSEGF (FA9550-11-C-0028) ve Ulusal Kanser Enstitüsü (1F99CA222541-01) aracılığıyla bu çalışmalarında desteklenmiştir. K.C.W. bir kariyer Ödülü Burroughs Wellcome fondan tıp bilim adamları için desteklenir ve Donald E. ve Delia B. Baxter Vakfı Fakültesi bilim adamı.
RPMI 1640 media | Life Technologies | 11875-119 | For K562 cell culture |
DMEM media | Life Technologies | 11995-065 | 1X, for 293T cell culture |
lentiCRISPR v2 | Addgene plasmid | #52961 | For CLOuD9 plasmid development |
pRSV-Rev | Addgene plasmid | #12253 | For lentivirus production |
pMD2.G | Addgene plasmid | #12259 | For lentivirus production |
pMDLg/pRRE | Addgene plasmid | #12251 | For lentivirus production |
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668-019 | For lentivirus production |
anti-HA antibody | Cell Signaling | 3724 | For immunoprecipitation |
anti-Flag antibody | Sigma | F1804 | For immunoprecipitation |
DNeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For DNA extraction |
TRIzol | Life Technologies | 15596-018 | For RNA extraction |
RNeasy Kit | Qiagen | 74106 | For RNA extraction |
Superscript VILO | Life Technologies | 11754-050 | For cDNA |
SYBR Green I MasterMix | Roche | 4707516001 | For qPCR analysis |
Light Cycler 480II | Roche | For qPCR analysis | |
anti-H3K4me3 antibody | AbCam | ab8580 | For ChIP-qPCR |
anti-RNA Pol-II antibody | Active Motif | 61083 | For ChIP-qPCR |
EDTA free protease inhibitor | Roche | 11873580001 | For protein extraction |
4-12% Tris Glycine gel | Biorad | Any size, For western blot | |
anti-Rabbit HRP antibody | Santa Cruz | sc-2030 | For western blot |
anti-mouse HRP antibody | Cell Signaling | 7076S | For western blot |
K562 and H3K293 ChIP-Seq data | Encode | ENCSR000AKU | For ChIP-seq analysis |
K562 and H3K293 ChIP-Seq data | Encode | ENCSR000APE | For ChIP-seq analysis |
K562 and H3K293 ChIP-Seq data | Encode | ENCSR000FCJ | For ChIP-seq analysis |
K562 and H3K293 ChIP-Seq data | GEO | GSM1479215 | For ChIP-seq analysis |
Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Thermo Fisher Scientific | 10001D | For immunoprecipitation |
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Thermo Fisher Scientific | 10004D | For immunoprecipitation |
RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | For RNA purification |
Pierce 16% Formaldehyde Methanol-free | Thermo Fisher Scientific | 28908 | For crosslinking |
PX458 Plasmid | Addgene | 48138 | Suggested active Cas9 plasmid for gRNA cloning, but any active Cas9 plasmid will do |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | For PCR purification |
FastDigest BsmBI | Thermo Fisher Scientific | FD0454 | For cloning guide RNAs |
FastAP | Thermo Fisher Scientific | EF0651 | For cloning guide RNAs |
10X FastDigest Buffer | Thermo Fisher Scientific | B64 | For cloning guide RNAs |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For cloning guide RNAs |
10X T4 Ligation Buffer | NEB | B0202S | For cloning guide RNAs |
T4 PNK | NEB | M0201S | For cloning guide RNAs |
2X Quick Ligase Buffer | NEB | B2200S | For cloning guide RNAs |
Quick Ligase | NEB | M2200S | For cloning guide RNAs |
Buffers | |||
Farnham lysis buffer | 1% Tris-Cl pH 8.0, 1% SDS, 1% protease inhibitor water solution (non-EDTA), and 1 mM EDTA in water | ||
Modified RIPA buffer | 1% NP40/Igepal, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, and 1% protease inhibitor water solution (non-EDTA) in PBS pH 7.8 or 7.4 | ||
IP dilution buffer | 0.01% SDS, 1.1% Triton-X 100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris-HCl pH 8.0, 167 mM NaCl, 0.1x protease inhibitor | ||
Wash buffer | 100 mM Tris pH 9, 100 mM LiCl, 1% NP-40, and 1% sodium deoxycholate | ||
Swelling buffer | 0.1 M Tris pH 7.5, 10 mM potassium acetate, 15 mM magnesium acetate, 1% NP-40 | ||
Dilution buffer | 0.01% SDS, 1.1% Triton X-100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris pH 8 and 167 mM NaCl | ||
IP elution buffer | 1% SDS, 10% NaHCO3 |