CRISPR-gemedieerde reorganisatie van chromatine lusstructuur
1Department of Dermatology, Program in Epithelial Biology,Stanford University School of Medicine, 2Program in Cancer Biology,Stanford University School of Medicine, 3Canary Center for Cancer Early Detection, Department of Radiology,Stanford University School of Medicine, 4Department of Biology,Bridgewater State University, 5System Biosciences, 6Veterans Affairs Healthcare System
Summary
Chromatine looping speelt een belangrijke rol in genregulatie; Nochtans, zijn er geen technologische vooruitgang, die het mogelijk voor selectieve en omkeerbare wijziging van chromatine loops maken. Hier beschrijven we een krachtig systeem voor chromatine lus opnieuw organisatie met behulp van CRISPR-dCas9 (CLOuD9), aangetoond dat zij selectief en omkeerbaar moduleren genexpressie bij gerichte loci.
Abstract
Recente studies hebben duidelijk aangetoond dat luchtverontreiniging over lange afstand, driedimensionale chromatine interacties spelen een belangrijke rol in de regulatie van genexpressie, maar of in een lus is verantwoordelijk voor of een gevolg van wijzigingen in genexpressie nog steeds is in een lus onbekend. Tot voor kort, is chromatine looping invloed van de verordening van gene activiteit en cellulaire functie relatief dubbelzinnig, en beperkingen in de bestaande methoden voor het manipuleren van deze structuren voorkomen diepgaande verkenning van deze interacties. U kunt oplossen door deze onzekerheid, we een methode voor selectief en omkeerbare chromatine lus opnieuw organisatie ontworpen met behulp van CRISPR-dCas9 (CLOuD9). De dynamiek van het systeem van CLOuD9 is aangetoond door de succesvolle lokalisatie van CLOuD9 constructies te richten genomic loci te moduleren lokale chromatine conformatie. De mogelijkheid om te keren van de geïnduceerde contactpersoon en herstellen van de endogene chromatine conformatie is bovenal ook bevestigd. Modulatie van genexpressie met deze methode stelt de capaciteit te regelen van cellulaire genexpressie en onderstreept de grote mogelijkheden voor toepassingen van deze technologie bij het creëren van stabiele DOVO chromatine loops die sterk van invloed zijn op gene expressie in de context van kanker en ontwikkeling.
Introduction
De relatie tussen chromatine vouwen in de kern en de specifieke organisatie van het genoom oogstte significant belang in de afgelopen jaren, zoals is gebleken te zijn nauw samen met gene expression1,2. Hoewel de precieze relatie tussen gene activiteit en modulatie van de structuur van de chromatine onduidelijk blijft, het heeft zijn veronderstelde dat de interacties tussen chromosomale contacten als gevolg van dynamische driedimensionale chromatine organisatie dienen een Gene regulerende functie3. Inderdaad, dergelijk effect is ook aangetoond bij de menselijke globine gen locus, waar de locus controle regio (LCR) de activiteit van het globine-genen in een ontwikkelingsachterstand specifieke wijze regelt door het creëren van een lus van de chromatine tussen de twee regio’s4. In zowel deze en andere regio’s is het echter onduidelijk of chromatine looping is een oorzaak of gevolgen van wijzigingen in genexpressie.
Tot nu toe bleef de uitdagingen bij het bestuderen van dit verschijnsel niet opgelost. Bijvoorbeeld, betrokken andere pogingen tot inducerende chromatine lussen wijzigen de lineaire opeenvolging van DNA of ingewikkelde procedures vereisen een overvloed aan achtergrondkennis op specifieke elementen die looping5,6vergemakkelijken, 7,8. Bovendien, terwijl eerdere werk heeft gesuggereerd dat chromatine lussen station genexpressie in een specifieke en beperkte context7,is8, het niveau op welke chromatine transcriptie wereldwijd in een lus raakt onzeker. Al belangstelling voor de gevolgen van luchtverontreiniging over lange afstand in een lus op genexpressie is gegroeid in de afgelopen jaren voortdurend, blijven er onbeantwoorde vragen over de vaststelling van en het behoud van de chromatine contacten ga gene activiteit bestaan.
De technologie die we hebben ontworpen maakt gebruik van de nuclease gebrekkig geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR) – CRISPR – geassocieerde proteïne 9 (dCas9), te voorzien in breed toepasbare gerichte elke genomic loci9. Deze technologie elimineert de complexe kwesties in verband met wijzigingen van de lineaire opeenvolging van DNA en is toegankelijk zonder significante voorkennis van bepaalde onderdelen van de oneindige lus terecht. De tool is het meest opvallend, universele en breed toepasbare chromatine lussen herkend in ontwikkeling zo goed zoals in een verscheidenheid van ziekten, zoals kanker. De kracht van CLOuD9 wordt aangetoond door een omkeerbaar wijziging van de structuur van de lussen aan effectief moduleren genexpressie.
Protocol
1. gRNA Design Selecteer een programma voor het ontwerpen van standaard gRNA te ontwerpen de gids RNAs10. Aanvullende paren van de eerder ontwikkelde CLOuD9 constructies9 gebruiken (dat wil zeggen, ten minste 1 S. aureus (CSA) en 1 S. pyogenes (CSP) bouwen) voor elk experiment. Binnen de geselecteerde online design tool, gebruikt u de Protospacer aangrenzende Motif (PAM) reeks “NGG” met een lengte van de gids van 20 bp voor CSP en de PAM volgnummer “NNGRRT” met een lengte van de gids van 21 voor CSA. Kies gidsen gebaseerd op specificiteit scoren en gidsen op beide strengen te maximaliseren kansen op het verkrijgen van een werkende gids ontwerpen. Bestel 2 oligonucleotides per gids van een oligo-fabrikant: voor de voorwaartse oligo, “caccg” aan het einde 5′ van de gids-reeks, en voor de omgekeerde oligo toevoegen, “aaac” toevoegen aan de einde 5′ en ‘c’ aan de 3′-eind alvorens te bestellen. In eerste instantie het ontwerp van 3-5 gRNAs voor elk gebied van belang, verspreid over een gebied van de bp 250-1000. Beoordelen van de gRNA gericht op efficiëntie als volgt: Kloon geïdentificeerd gRNAs in een actieve Cas9 plasmide (zie stap 3) en Transient transfect in 293T cellen (zie stap 4)11. Groeien van cellen voor 2-3 d in de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine (pen strep), dan oogst en pak genomic DNA12. Beoogde regio’s versterken door de polymerase-kettingreactie (PCR). Uitvoeren van producten op een 1,5% agarose gel en te zuiveren van geschikte banden. Voert een T7 endonuclease test zoals beschreven in de Guschin, et al.. protocol13,14.Opmerking: Efficiënte gidsen worden bepaald om te snijden DNA op de doelsite. 2. de celkweek Cellen in een gezond en actief delen staat te handhaven. Voor K562s, cultuur in Roswell Park Memorial Instituut (RPMI) 1640 media met 10% FBS en 1% pen strep. Groeien K562s in een maatkolf van 25 cm2 gekanteld nek voor onderhoud en aanpassen van de celdichtheid aan 400.000 cellen per mL per dag. Nadat K562s hebben al getransduceerde met CLOuD9 construeert, 2 µg/mL puromycin en 100 µg/mL hygromycin toevoegen aan onderhoud media. Voor 293Ts, cultuur in de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) met 10% FBS en 1% pen strep. 293Ts in 10 cm2 platen groeien en gesplitst bij confluent. 3. plasmide voorbereiding en gRNA inbrengen15 Opmerking: Plasmide kaarten zijn beschikbaar in het aanhangsel en inleidingen gebruikt in de voorbeeld-experimenten zijn beschikbaar in de aanvullende tabel 1. Meng 5 µg voor het lentivirale CRISPR-plasmide met 3 µL van BsmBI, 3 µL van alkalische fosfatase, 6 µL van 10 x Buffer en 0.6 µL van vers bereide 100 mM DTT. Breng het totale volume aan 60 µL met ddH2O en Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten om te verteren en dephosphorylate van de plasmide. Gel zuiveren het verteerd plasmide en elueer in ddH2O. Meng 1 µL van elk van de gekoppelde gidsen op 100 µM met 1 µL van 10 x T4 afbinding Buffer, 6.5 µL van ddH2O en 0,5 µL T4 PNK, tot 10 µL totale volume. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten, dan 95 ° C gedurende 5 min, en vervolgens oprit tot 25 ° C bij 5 ° C/min.Opmerking: Dit zal het paar van gidsen ontharden. Verdun de ontharde gidsen (uit stap 3.3) 1:200 in ddH2O. Meng 1 µL van het verteerd plasmide uit stap 3.2 met 0,5 µL van de verdunde ligaturen gidsen vanaf stap 3.4, 2.5 µL van 2 x Buffer 1 µl van ddH2O en 0,5 µL van Ligase, om een 5.5 µL totale reactie. Incubeer dit bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten tot het afbinden van de gidsen voor de BsmBI verteerd plasmide. De nieuwe ligaturen plasmide uit stap 3.5 omvormen Stbl3 bacteriën en versterken met behulp van een plasmide voorbereiding methode. 4. lentivirus productie Graaf 750.000 293T cellen per putje voor een zes-well plaat met behulp van een hemocytometer en zaad ze in DMEM met 10% FBS en 1% pen strep. Een goed gebruik voor elke constructie. 24 h na het zaaien, media omzetten in verse antibioticum-vrije DMEM met 10% FBS. Verdun in een buis, 11 µL van lipide gebaseerde transfectiereagens met 150 µL van het OptiMEM medium, per reactie11. Verdun in een aparte buis, 2 µg van de CLOuD9 lentivirale vector plasmide uit stap 3.6, 0.35 µg pMDLg/pRRE, 1 microgram van pRSV-Rev en 0,65 µg pMD2.G met 150 µL van het OptiMEM medium, per reactie11. Voor elke reactie, het mengsel van verdunde lentivirale plasmide toevoegen aan de verdunde lipide gebaseerde transfectiereagens op een 1:1-verhouding, en incubeer gedurende 5 min11. Het gehele volume van elke gemengde complex uit stap 4.5 in de respectieve putten van de antibiotica-vrij 293T cellen uit stap 4.2 toevoegen. 48 uur later verzamelen virale productie media door pipetteren in een verse buis en de spin naar beneden bij 300 x g gedurende 5 min. Na het centrifugeren, door het supernatant naar een verse buis te verwijderen van de overblijvende cel puin te verplaatsen. Gebruiken van virale productie media onmiddellijk voor de transductie van doelcellen of bevriezen bij-80 ° C voor toekomstig gebruik. 5. lentivirus signaaltransductie van cellen 250 µL voor elke virale construct van belang (samengesteld uit complementaire CLOuD9 plasmiden) toevoegen aan een conische tube van 15 mL met 80.000 cellen voor de toepassing van CLOuD9. Zodat het totale volume van media in elk kegelvormig tot 1 mL met antibioticum-vrije media, en polybrene toevoegen aan een eindconcentratie van tussen 1-8 µg Mo/mL (de maximale concentratie van polybrene getolereerd door het celtype gebruikt moet experimenteel worden bepaald). Spin cellen bij 800 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en resuspendeer door pipetteren zonder het verwijderen van het supernatans dat virale. Verplaats de hele celsuspensie naar een cel cultuur plaat. 24u na signaaltransductie, cellen van de spin naar beneden bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gecombineerd virale supernatant en resuspendeer de cellen in regelmatige cel voedingsbodems. Op de volgende dag, puromycin (1 µg/mL voor 293T cellen) en hygromycin (25 µg Mo/mL voor 293T cellen) toevoegen aan het kweekmedium cel selecteren voor dubbel getransduceerde cellen. Experimenteel bepalen de juiste concentraties van puromycin en hygromycin voor een bepaald celtype voorafgaand aan het begin van de experimenten. Houden van cellen in de selectie media voor ten minste 3 d voordat alle downstream experimenten en gedurende de duur van alle experimenten in selectie media. 6. cel dimerisatie en Wash uit Toevoegen van 1 mM Abscisic zuur (ABA) of een gelijkwaardige hoeveelheid dimethylsulfoxide (DMSO) voor besturingselementen aan de cultuur van de cel aan het dimerize van de CLOuD9 geselecteerd en getransduceerde cellen. ABA te gebruiken binnen 6 maanden na de datum van ontvangst, koud houden en beschermen tegen licht in gebruik. 2 mM ABA kan worden gebruikt indien nodig. Omzetten in media dagelijks voorzien van verse ABA (of DMSO voor besturingselementen) voor de duur van de experimenten.Opmerking: Geen limiet op de lengte van de dimerisatie nog geconstateerd. Omgekeerde dimerisatie door eliminatie van media met ABA en wassen van cellen met genoeg fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) ter dekking van het oppervlak van de plaat twee keer. Daarna cultuur cellen in ABA-vrije media een un-dimerized toestand te handhaven. 7. Immunoprecipitation en Co-immunoprecipitations Opmerking: Controleer alle buffers fris en onmiddellijk voorafgaand aan het gebruik. Na voltooiing van de dimerisatie experimenten, verzamelen en spin down cellen, dan supernatant gecombineerd. Dwarslijn en bevriezing van cellen Maak een verse voorraad van 1% formaldehyde in PBS bij kamertemperatuur met verse materialen. Voor elke 2 miljoen cellen, zachtjes resuspendeer met 1 mL van de 1% formaldehyde bij kamertemperatuur gedurende precies 10 minuten, terwijl het draaien.Opmerking: Gebruik een minimumgrootte voor het volume van 10 mL voor crosslinking minder dan 10 miljoen cellen. Doven crosslinking met de toevoeging van glycine aan een eindconcentratie van 0,125 M, gevolgd door incubatie gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, terwijl het draaien. Spin down cellen en wassen van 1-2 x met ijskoude PBS. Cel pellets kunnen module in vloeibare stikstof bevroren en opgeslagen bij-80 ° C of onmiddellijk gebruikt worden.Opmerking: De warmte zal formaldehyde crosslinks omkeren. Als het stormde, kunnen cellen rechtstreeks worden opgeslagen in-80 ° C zonder de module bevriezen. Bereiden van geconjugeerde antilichaam/kraalOpmerking: Optimaliseren voorwaarden voor gekozen antilichaam (dat wil zeggen, het testen van verschillende lysis buffers voor lysis van de cel en het uitvoeren van IP) wellicht de moeite waard. Twee gemeenschappelijke buffers, Farnham lysis-buffermengsel en bewerkt RIPA buffer, kunnen een significant effect op het rendement van de IP- en ultrasoonapparaat rendement hebben. Alle composities van de buffer kunnen worden gevonden in de Tabel van materialen. Bovendien, houd er rekening mee dat chromatine ultrasoonapparaat kan enkele uren duren. Resuspendeer kralen door vortexing kort al naargelang het gekozen antilichaam. Een passend bedrag van kralen voor het experiment overbrengen in een 1,5 mL-buis. Als uitgangspunt, 20 µL van parels voor elke 1 µg van antilichaam te gebruiken. Voeg nog geen antilichamen.Opmerking: Gebruik 10 µg antilichaam met 200 µL van parels voor 1 mg totaal lysate als uitgangspunt, tenzij het is bekend dat het antilichaam meer of minder efficiënt dan dat zou kunnen inhouden. Voor lage overvloed eiwitten, kan deze verhouding moeten worden aangepast. Als gebruikt Farnham lysis-buffermengsel, wassen 3 x in IP-verdunning buffer. Als met behulp van RIPA lysis-buffermengsel, wassen 3 x in RIPA lysis-buffermengsel. Resuspendeer kralen in een eindvolume van de dezelfde buffer uit stap 7.3.3 (IP-verdunning of RIPA buffer) thats > 1 x en < 5 x het oorspronkelijke volume. dat wil zeggen Gebruik voor 100 µL eerste kraal volume, tussen 100 en 500 µL definitieve resuspensie volume. Antilichaam aan gewassen kralen nu met een geschikte concentratie toevoegen. Voor een goede HA of vlag antilichaam aan IP-CLOuD9 constructies, gebruik van antilichamen op 1:50 (µg eiwit: µg eiwit lysate) en incubeer tussen 8 + h en ‘s nachts bij 4 ° C, terwijl het draaien. Als alternatief, Incubeer gedurende 2-4 uur bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant van kralen en negeren. Wash kralen 3 x met de Wash-buffer. Resuspendeer in een minimale omvang van de buffer gebruikt voor overnachting incubatie met de antilichamen (IP-verdunning of RIPA buffer). Houden koude tot gecombineerd met eiwit lysate. Bewerk de chromatine ultrasone trillingen ten Eerst lyse cellen met de toevoeging van zwelling buffer cel pellets op ijs voor 10 min, flicking cellen elke paar minuten om te voorkomen dat regelen.Opmerking: In het algemeen, 500 µL van de zwelling van de buffer is toegevoegd aan 25 miljoen cellen en vanuit daar geschaald, maar doen niet gebruik minder dan 500 µL buffer voor < 25 miljoen cellen. Dounce handmatig zowel rechtsom en linksom, 13 x elk. Kernen van de spin naar beneden bij 4 ° C gedurende 5 minuten bij de 1.500 x g. gecombineerd het supernatant volledig en herhaal dit om te resterende bovendrijvende vloeistof verwijderen, dan wegen de cel pellet in mg. Proteaseinhibitor toevoegen aan kernen lysis-buffermengsel (Farnham buffer of RIPA buffer, hierboven, kies een). 10 x bedrag van kernen lysis-buffermengsel aan Ingehuld kernen aan resuspendeer toevoegen (bijvoorbeeld het toevoegen van 1 mL lysisbuffermengsel kernen aan een pellet 0.100 g). Kort vortex en lyse voor 10 min op ijs.Opmerking: Houd in mening de grootte van de buis ultrasoonapparaat. Ideaal volume is vaak < 1 mL, dus monsters worden verdeeld moeten mogelijk als pellets zeer groot zijn. Voor Co-IP, bewerk ultrasone trillingen ten kernen kort te solubilize materiaal quench SDS naar een peil waarop algemene immunoprecipitation met 2-3 volumes van verdunning buffer, dan gaat u verder met stap 7.4.6. Voor zeer gevoelige antilichamen, voegt u meer verdunning buffer om verdere verlaging van de concentratie van SDS.Opmerking: Stop ultrasoonapparaat als lysate wist; het zal veranderen van een dekkend/transparant wit naar volledig transparant. Houd de monsters zo koud mogelijk en doen niet over Bewerk ultrasone trillingen ten. Voor ChIP, grondig Bewerk ultrasone trillingen ten DNA om te verkrijgen 150-1000 bp DNA-fragmenten, dan gaat u verder met stap 7.4.6. Spin uit onoplosbare materiaal op maximale snelheid gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Oplosbaar materiaal overbrengen in een verse buis. Voor Co-IP, meten van de concentratie van eiwit en overgaan tot de pulldown in stap 7.5. Voor ChIP, het verwijderen van een hoeveelheid van 10 µL lysate gewist en voeg 40 µL IP-elutie buffer en 6 µL 5 M NaCl aan dat voor een totaal van 56ul. Kook gedurende 15 minuten staan bij 95 ° C, voeg 5-10 µL van 3 M NaOAc pH 5 en schoon te maken op een PCR zuivering kolom. Meten van de concentratie van DNA door het meten van de absorptie bij 260 nm en in alle monsters standaardiseren. Dan overgaan tot pulldown in stap 7.5.Opmerking: Extra lysate kan worden module bevroren bij-80 ° C en gebruikt op een later tijdstip, maar de beste resultaten worden verkregen van de fresh lysate. Als bevriezing, doen geen vorst/dooi lysate meer dan eens. Keuzelijst Een geschikte hoeveelheid van een eiwit lysate overbrengen in een verse buis. Als gebruikt Farnham lysis-buffermengsel, Verdun in 2.1 volumes van IP-verdunning buffer (boven). 100 µL van supernatans voor invoercontrole gereserveerd en bewaren bij 4 ° C tot de volgende dag. Voeg parel/antilichaam conjugaat nu vanaf stap 7.3.8 aan monsters. Monsters bij 4 ° C’s nachts draaien en zorgen er genoeg volume voor vloeibare beweging in 1,5 mL tubes. Wassen en elueer Na overnachting rotatie, sla het supernatant als het niet-bindende deel. Vervolgens kralen wassen 3-5 x in IP-verdunning buffer. IP-elutie buffer bij kamertemperatuur, zonder remmers te bereiden. Elueer complexen met 50 µL elutie buffer geschud op een draaikolk bij 67 ° C gedurende 15 min. overdracht elutie tot een nieuwe koker en herhaal met nog eens 50 µL. Combineer ze allebei voor een totale 100 µL elutie.Opmerking: Als er te veel achtergrond van deze procedure elutie, warmte kan worden verminderd of geëlimineerd tijdens het schudden/incubatie. Dit in het algemeen vermindert het rendement van de doelstelling eiwit maar leiden tot aanzienlijke afname van de achtergrond. Omkeren van crosslinks door verwarming bij 67 ° C gedurende > 4 h.Opmerking: Dit is niet strikt noodzakelijk zijn voor mede IPs maar nuttig kan zijn. Voor Co-IP, om ervoor te zorgen volledige dimerisatie tussen de doelstellingen van belang, voer eluaten op een SDS-pagina gel en sonde met antistoffen tegen de HA tag of tag van de vlag, zoals aangegeven, allemaal op 1: 1.000. Ga verder met stap 8. ChIP-qPCR, om ervoor te zorgen correct lokalisatie en doelgerichtheid van elk onderdeel van de CRISPR-dCas9, schoon elutie product op een kolom en elueer in 10 µL. uitvoeren real-time kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR) van gezuiverde DNA. Inleidingen gebruikt in de gepresenteerde gegevens zijn beschikbaar in de aanvullende tabel 1. Ga verder met stap 8. 8. RNA extractie en kwantitatieve PCR Om te onderzoeken de CLOuD9-geïnduceerde veranderingen in genexpressie, eerst isoleren en zuiveren van totaal RNA van zowel controle cel korrels en pellets, dimerized cel. Maken van cDNA (cDNA) uit de gezuiverde RNA door omgekeerde transcriptie17 en qPCR-analyses uitvoeren. De inleidingen zijn beschikbaar in de aanvullende tabel 1. 9. chromosoom conformatie Capture Assay Testen8observeren van veranderingen in de frequentie van genomic loci contacten geïnduceerd door CLOuD9, uitvoeren van chromosoom conformatie vastleggen (3C). 3C afbinding producten in twee sets van dubbele waarden voor elk van de drie biologische wordt gerepliceerd door kwantitatieve PCR in real time te kwantificeren. Normaliseren monsters naar de 3C-signalen van de locus tubuline. De inleidingen zijn beschikbaar in de aanvullende tabel 1.
Representative Results
CLOuD9 induceert omkeerbare β-globin promotor-LCR looping. Passend gebruik van het systeem van CLOuD9 induceert omkeerbare contact van de complementaire CSA en CSP CLOuD9 construeert door toevoeging of verwijdering van ABA naar cel voedingsbodems (Figuur 1a). CSA en CSP constructies (Figuur 1b) zijn gelokaliseerd aan passende genomic regio’s met behulp van standaard CRISPR gRNAs. Gezien de enorme documentatie van de menselijke globine locus evenals de frequente chromosomale vouwen en de omlegging die er tijdens de ontwikkeling van optreedt deze regio werd gekozen om aan te tonen het nut van het systeem van CLOuD9. Bovendien werd de cellijn van K562 omdat het is aangetoond dat het consequent express hoge niveaus van de foetale γ-globine-gen, in tegenstelling tot de β-globine-gen dat meestal in gezonde volwassen erythroid lineage cellen uitgedrukt wordt geselecteerd. Met behulp van de K562 cellen, kan het vermogen van CLOuD9 wijzigen genexpressie door probeert te herstellen van de expressie van de β-globine-gen in de cellijn van deze worden onderzocht. Voorafgaand aan de inductie van dimerisatie, chromatine immunoprecipitation-kwantitatieve PCR (ChIP-qPCR) werd gebruikt om ervoor te zorgen nauwkeurige lokalisatie en doelgerichtheid van elke component van de CLOuD9 (aanvullende figuur 1). Bovendien, co-immunoprecipitation (Co-IP) met en zonder ABA geverifieerd CSA en CSP dimerisatie in aanwezigheid van de ligand, evenals de omkeerbaarheid bij gebrek aan de ligand (Figuur 1 c en aanvullende figuur 2). 24 h na het toevoegen van ABA, meer contact tussen β-globin en de LCR verscheen zoals gemeten door chromosoom conformatie vastleggen (3C) in de cellen met beide dimerisatie delen, maar niet voor de besturingselementen slechts twee CSA of CSP constructies, aldus valideren met de specificiteit van de chromatine verandering voor de gerichte sites (Figuur 1 c en aanvullende cijfers 3,4). De LCR-β-globine-interactie maken deed niet volledig elimineren de endogene LCR-globine-contact, maar in plaats daarvan toegevoegd aan de oorspronkelijke contactpersoon, als eerder gemeld8. Stijgingen van de contacten van de β-globine/LCR werden waargenomen voor maximaal 72 uur van dimerisatie, ongeacht de exacte regio binnen de gerichte LCR en β-globin promotor regio (aanvullende cijfers 5,6). Tot slot, de omkeerbaarheid van het systeem werd bevestigd met 3C na het verwijderen van ABA, waaruit bleek een volledige vernieuwing van de endogene conformatie (Figuur 1 d en aanvullende figuren 3-6). We hebben overwogen dat het succes komt te staan in de K562 cellen een resultaat van het globine locus locatie in een gebied van euchromatine (Figuur 1 d), zijn kan dus een tweede cellijn werd gebruikt voor het verkennen van dit idee. De CLOuD9 systeem werd toegepast op HEK 293T cellen in regio’s die zijn hétérochromatique en doen niet express globine genen (Figuur 1e). Het resultaat was vergelijkbaar met wat werd waargenomen in K562s; meer β-globin LCR verenigingen werden gemeten door 3C na 24 h met ABA (Figuur 1e en aanvullende figuur 3), bewijze voor CLOuD9 van robuuste vermogen om te functioneren in verschillende cellulaire omgevingen, ondanks de oorspronkelijke toestand van de chromatine of bevleesdheid. Extra loci werden getest om ervoor te zorgen de brede toepasbaarheid van CLOuD9, met inbegrip van een distale 5′ versterker binnen 293T cellen en de promotor van de Oct4. Eerder, is er geen aantoonbaar Oct4 uitdrukking in deze cellijn en verder, endogene maakcontacten beschreven. Bewijs van Oct4 expressie in embryonale stamcellen ten gevolge van contacten met de distale 5′ enhancer gemotiveerd dit experiment, en dezelfde uitkomst werd waargenomen op de β-globin locus18. Contact tussen de Oct4 distale enhancer en promotor werd geïdentificeerd in de cellen van de CLOuD9 ingeschakeld, maar niet de controle cellen (Figuur 1f). Daarnaast werd naar voren gebracht dat de promotor van de Oct4 en de distale 5′ enhancer interactie ook gevraagd een versterker 3′ contact opnemen met de organisator van de Oct4. Deze gebeurtenis komt overeen met het bewijs dat de 3′-enhancer met de Oct4 promotor/5 samenwerkt ‘ distale enhancer complexe tijdens endogene gene activering10. CLOuD9 induceert de specifieke wijzigingen van de context op gene loci. Nadat u hebt bevestigd dat de CLOuD9 systeem inderdaad toe chromosomale contacten op gene loci brengt er, wilden we onderzoeken de lussen effect op de genexpressie. Het is gedocumenteerd dat transcriptie voor de globine en Oct4 genen zijn afhankelijk van de contacten tussen de LCR en globine gen loci en tussen de distale 5’ versterker en Oct4 promotor, respectievelijk1,11. Dus, we veronderstelde dat het gebruik van de CLOuD9 systeem tot station chromatine lus vorming in elk van deze regio’s leiden een dwingende genexpressie tot zou. In beide loci, RT-qPCR aangetoond dat ABA geïnduceerde chromatine lussen reed stijgingen van Oct4 expressie in 293T cellen, en zijn in β-globin expressie in K562 cellen, maar niet in 293Ts (Figuur 2a). Hoewel de toevoeging van ABA naar cel cultuur voor zo weinig zoals 24 h-en toenemende-β-globin expressie aanzienlijk, expressie bleef stijgen gestaag tot 72 uur en was omkeerbare op ABA wassen (Figuur 2a). Alle K562 cellen met uitzondering van de besturingselementen volgden deze trend, ongeacht waar de dimerisatie onderdelen bij het LCR en β-globin promotor regio’s (Figuur 2a en aanvullende cijfers 7,8 ondergebracht waren). Ter ondersteuning van deze bevindingen correspondeerde ChIP-qPCR van H3K4me3 en RNA Pol-II op de β-globin locus in K562s en 293Ts met de waargenomen veranderingen in de transcriptie (Figuur 2 c-f). CLOuD9 vaststelt stabiele chromatine lussen. Hoewel op korte termijn lus inductie met CLOuD9 gevolgd duidelijk verwachtingen, of op lange termijn inductie van looping Differentiele effecten gebleven in acht moeten worden genomen. Om dit te onderzoeken, werden cellen gekweekt in het bijzijn van ABA voor 10 dagen. Terwijl zowel de K562s als de 293Ts tentoongesteld verhoogde contact frequentie tussen de β-globin locus en de LCR ten opzichte van de besturingselementen (Figuur 3a, b en aanvullende cijfers 9,10), werden wijzigingen in β-globin expressie nog steeds alleen waargenomen in de K562 cellen (Figuur 3 c). Interessant, echter, werd naar voren gebracht dat op lange termijn dimerisatie in K562s, waar de transcriptie sterk upregulated was, was geen langer omkeerbaar (Figuur 3a en aanvullende figuren 9-11). Echter, in 293Ts, waar geen wijziging in de transcriptie werd waargenomen na langdurige dimerisatie, geïnduceerde veranderingen in chromatine contacten bleef omkeerbaar (Figuur 3b en aanvullende figuur 9). Over het algemeen werd slechts een kleine daling in genexpressie waargenomen na 10 dagen van ABA verwijdering, die aanzienlijk hoger dan gen expressie niveaus vóór dimerisatie (Figuur 3 c bleven). In overeenstemming met dit, K562 cellen, maar niet 293T cellen, toonde duurzame veranderingen in H3K4me3 en RNA Pol-II op de β-globin locus door ChIP-qPCR, in vergelijking met besturingselementen, zelfs na 10 dagen van ABA verwijdering (figuur 3d-f). Zo blijkt uit onze resultaten dat de stabiliteit van de chromatine lus meer duurzame genexpressie impliceert. Figuur 1: CLOuD9 induceert omkeerbare β-globin promotor-LCR looping. (a) toevoeging van abscisic zuur (ABA, groene) brengt twee complementaire CLOuD9 constructies (CLOuD9 S. pyogenes (CSP), CLOuD9 S. aureus (CSA), rood en blauw, respectievelijk) in de nabijheid, structuur van de chromatine remodeling. Verwijdering van ABA herstelt de endogene chromatine bevleesdheid. (b) CLOuD9 constructies combineren CRISPR-dCas9-technologie van S. aureus en S. pyogenes met omkeerbaar dimerizeable PYL1 en ABI1 domeinen. (c) tijdlijn van CLOuD9 dimerisatie experimenten. (d) 3 C assay meten β-globin locus bestrijkende crosslinking frequenties in K562 cellen na 24 h behandeling met de ABA (rood) en latere wassen (blauw) toont omkeerbaarheid van geïnduceerde contacten van de β-globine/LCR (gemarkeerd in het grijs). Oranje pijlpunten geven specifieke CLOuD9 construct doelregio’s. Het fragment van de EcoRI met overgevoeligheid sites 1-4 van de LCR (zwarte balk) werd gebruikt als de anker-regio. De frequentie van de crosslinking met andere aangegeven EcoRI fragmenten (namen op de bovenkant van de grafiek) werden beoordeeld. De menselijke β-globine genen en LCR overgevoeligheid sites staan afgebeeld op de onderkant van de grafiek met chromosomale positie coördinaten. Gegevens van ChIP-seq van H3K4me3 en H3K9me3 laten zien dat deze regio euchromatique in K562s (e) vergelijkbaar omkeerbare veranderingen in de structuur van de chromatine in HEK 293T cellen, ondanks bewijzen van H3K4me3 en H3K9me3 ChIP-seq gegevens worden gezien die de globine regio is hétérochromatique in dit celtype. (f) 3 C assay meten Oct4 locus bestrijkende crosslinking frequenties in 293T cellen na 72 uur van een behandeling met de ABA (rood) weergegeven: Oct4/distale enhancer contacten geïnduceerde (gemarkeerd in het grijs). Oranje pijlpunten geven specifieke CLOuD9 construct doelregio’s. Het fragment van de MboI met de Oct4 promotor (zwarte balk) werd gebruikt als de anker-regio. De frequentie van de crosslinking met andere aangegeven MboI fragmenten (namen op de bovenkant van de grafiek) werden beoordeeld. De menselijke Oct4 regio’s staan afgebeeld op de onderkant van de grafiek met chromosomale positie coördinaten. Alle 3C resultaten werden verkregen uit ten minste drie onafhankelijke experimenten. 3C waarden zijn genormaliseerd naar tubuline. Voor β-globin, waren interactie frequenties tussen het anker-fragment en het fragment omvat het fragment β/HS ingesteld op nul. Interactie frequenties tussen het anker-fragment en een fragment van de negatieve controle buiten de Oct4 interactie regio waren Oct4 ingesteld op nul. Foutbalken geven s.d. n = 3. Dit cijfer is gewijzigd van Figuur 1 in Morgan, Stefanie L., et al.. 9. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 2: CLOuD9 induceert specifieke wijzigingen van de context in gen-expressie en chromatine staat. (a) CLOuD9-geïnduceerde chromatine looping de β-globin locus resultaten in de omkeerbare inductie van β-globin expressie in K562s maar niet in 293Ts. betekenis gegeven ten opzichte van de behandelde cellen. Tweezijdige student t-test * P < 0,05, t = 3.418, df = 5; P < 0.0001, t = 10.42 df = 5; n.s. niet-significant. Foutbalken geven s.d. n = 3. (b) een inductie van Oct4 expressie werd waargenomen in 293Ts na CLOuD9-geïnduceerde lus op de zelfde locus. Betekenis wordt gegeven ten opzichte van de behandelde cellen. Tweezijdige student t-test * P < 0,05, t = 4.562, df = 2. Foutbalken geven s.d. (c) schema van ChIP-qPCR primer locaties langs de β-globine gen lichaam. (d, e) ChIP-qPCR toont omkeerbare veranderingen in het H3K4me3 op de β-globin locus in K562s maar niet in 293Ts na CLOuD9-geïnduceerde looping. Tweezijdige student t-test * P < 0,05, ** P < 0.001, *** P < 0,0001. Foutbalken geven s.d. (f) CLOuD9 gemedieerde wijzigingen in β-globin transcriptie in K562s komen met de stijgingen van de bezetting van RNA Pol-II over het geheel van de β-globine gen lichaam overeen. Tweezijdige student t-test * P < 0,05, ** P < 0.001, *** P < 0,0001. Foutbalken geven s.d. Dit cijfer is gewijzigd van Figuur 2 in Morgan, Stefanie L., et al.. 9. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 3: CLOuD9 vaststelt stabiele chromatine loops die robuuste genexpressie na langdurige dimerisatie ondersteunen. (a, b) 3 C assay toont aan dat in de K562s maar niet 293Ts, CLOuD9-geïnduceerde chromatine looping onomkeerbaar na 10 dagen van ABA behandeling, wordt zelfs wanneer ABA voor maximaal 10 extra dagen wordt verwijderd. Alle 3C resultaten werden verkregen uit ten minste drie onafhankelijke experimenten. 3C waarden zijn genormaliseerd naar tubuline en interactie frequenties tussen het anker-fragment en het fragment omvat het fragment β/HS waren ingesteld op nul. Foutbalken geven s.d. n = 3. (c) de stabilisatie van de lus in K562s resulteert in permanente uitdrukking van β-globin, zelfs na 10 dagen van ABA wassen. Geen veranderingen in β-globin expressie worden waargenomen bij 293Ts. betekenis gegeven ten opzichte van de behandelde cellen. Tweezijdige student t-test *** P < 0.0001, t = 5.963, df = 5; n.s. niet-significant (d) ChIP-qPCR weergegeven: stijging van de H3K4me3 merken over de β-globin locus in reactie op CLOuD9-geïnduceerde looping zijn opgelopen na 10 dagen van ligand wassen in K562s. tweezijdige student t-test * P < 0,05, ** P < 0.001, *** P < 0,0001. (e) geen belangrijke wijzigingen in H3K4me3 signalen volgende langdurige dimerisatie werden waargenomen door ChIP-qPCR in 293Ts. (f) verhoogd RNA Pol-II bezetting van de β-globin locus na lange lus inductie bleef in K562s volgende 10 dagen van ligand wassen. Tweezijdige student t-test * P < 0,05, ** P < 0.001, *** P < 0,0001. Alle foutbalken geven s.d. Dit cijfer is gewijzigd van Figuur 3 in Morgan, Stefanie L., et al.. 9. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Aanvullende figuur 1: CLOuD9 constructies lokaliseren naar hun beoogde doel gebieden. Chromatine immunoprecipitation en kwantitatieve PCR van CLOuD9 constructies tonen aan de juiste localization voor hun beoogde genomic loci. Dit cijfer is gewijzigd van aanvullende figuur 1 in Morgan, Stefanie L., et al.. 9. please click here to download dit cijfer. Aanvullende figuur 2: CLOuD9 constructies omkeerbaar koppelen in reactie op behandeling van ABA. Co-immunoprecipitations aantonen van de vereniging van de dCas9 eiwitten volgende 72 h van ABA behandeling is omgekeerd volgende latere 72 h van ligand wassen. Dit cijfer is gewijzigd van aanvullende figuur 2 in Morgan, Stefanie L., et al.. 9. please click here to download dit cijfer. Aanvullende figuur 3: controle behandeling induceert geen wijzigingen in de contacten van de chromatine. Behandeling met DMSO, een agent van de controle, voor 24 uur induceert geen wijzigingen in de gedaante van de endogene chromatine door 3C in beide K562 cellen of HEK 293Ts. 3C waarden zijn genormaliseerd naar tubuline en interactie frequenties tussen het anker-fragment en het fragment omvat het fragment β/HS waren ingesteld op nul. Foutbalken geven SD. n = 3. Dit cijfer is gewijzigd van aanvullende figuur 3 in Morgan, Stefanie L., et al.. 9. please click here to download dit cijfer. Aanvullende figuur 4: controle CLOuD9 getransduceerde cellen geen wijzigingen vertonen chromatine looping. Leiden twee CLOuD9 bouwt aan hetzij de LCR of de β-globine-promotor induceert geen significante veranderingen in de structuur van de chromatine door 3C na ABA behandeling ten opzichte van de controle behandeling. 3C waarden zijn genormaliseerd naar tubuline en interactie frequenties tussen het anker-fragment en het fragment omvat het fragment β/HS waren ingesteld op nul. Foutbalken geven SD. n = 3. Dit cijfer is gewijzigd van aanvullende figuur 4 in Morgan, Stefanie L., et al.. 9. please click here to download dit cijfer. Aanvullende figuur 5: omkeerbare CLOuD9 chromatine looping blijft na 72 uur na de dimerisatie. 3C assay in K562s toont omkeerbaarheid van CLOuD9 geïnduceerde contacten van de β-globine/LCR na 72 uur van ABA behandeling. 3C waarden zijn genormaliseerd naar tubuline en interactie frequenties tussen het anker-fragment en het fragment omvat het fragment β/HS waren ingesteld op nul. Foutbalken geven SD. n = 3. Dit cijfer is gewijzigd van aanvullende figuur 5 in Morgan, Stefanie L., et al.. 9. please click here to download dit cijfer. Aanvullende figuur 6: CLOuD9 geïnduceerde β-globine/LCR lus wordt niet beïnvloed door globine doelsite. Leiding van de CSA en CSP construeert alternatieve regio’s van het LCR of de β-globin promotor resultaten in vergelijkbare omkeerbare veranderingen in lus inductie door 3C na 72 uur van ABA behandeling. 3C waarden zijn genormaliseerd naar tubuline en interactie frequenties tussen het anker-fragment en het fragment omvat het fragment β/HS waren ingesteld op nul. Foutbalken geven SD. n = 3. Dit cijfer is gewijzigd van aanvullende figuur 6 in Morgan, Stefanie L., et al.. 9. please click here to download dit cijfer. Aanvullende figuur 7: CLOuD9 geïnduceerde wijzigingen in genexpressie zijn opgelopen ongeacht globine doelsite. Leiding van CSA en CSP wordt naar alternatieve regio’s van de β-globine-promotor en LCR heeft geen invloed op de inductie van genexpressie na 72 h van dimerisatie. Echter, terwijl sommige invloed op de sterkte van genexpressie volgende op lange termijn (10 dagen) dimerisatie werd waargenomen, hoge niveaus van β-globin ten opzichte van de behandelde cellen waren aanhoudende volgende latere ligand wassen voor 10 extra dagen. Betekenis wordt gegeven ten opzichte van de behandelde cellen. p < 0.001, t = 10.25, df = 5; p < 0,0001, van links naar rechts t = 8.697, df = 6, t = 40.31, df = 7; n.s. niet-significant. Alle foutbalken geven SD. Dit cijfer is gewijzigd van aanvullende figuur 7 in Morgan, Stefanie L., et al.. 9. please click here to download dit cijfer. Aanvullende figuur 8: controle CLOuD9 getransduceerde cellen geen wijzigingen in β-globin expressie weergeven. Leiden twee CLOuD9 bouwt aan hetzij de LCR of de β-globine-promotor induceert geen significante veranderingen in β-globin expressie na ABA behandeling ten opzichte van de controle behandeling. Betekenis wordt gegeven ten opzichte van de behandelde cellen. n.s. niet-significant. Dit cijfer is gewijzigd van aanvullende figuur 8 in Morgan, Stefanie L., et al.. 9. please click here to download dit cijfer. Aanvullende figuur 9: langdurige controle behandeling induceert geen wijzigingen in de contacten van de chromatine. Behandeling met DMSO, een agent van de controle, voor 10 dagen induceert geen verandering in de endogene chromatine conformatie door 3C in beide K562 cellen of HEK 293Ts. 3C waarden zijn genormaliseerd naar tubuline en interactie frequenties tussen het anker-fragment en het fragment omvat het fragment β/HS waren ingesteld op nul. Foutbalken geven SD. n = 3. Dit cijfer is gewijzigd van aanvullende figuur 9 in Morgan, Stefanie L., et al.. 9. please click here to download dit cijfer. Aanvullende figuur 10: Long-term CLOuD9 geïnduceerde β-globine/LCR lus wordt niet beïnvloed door globine doelsite. Leiding van CSA en CSP construeert naar andere regio’s van de LCR of de β-globin promotor resultaten in onderhoudende ook inductie lus zoals blijkt uit 3C na 10 dagen van ABA behandeling en 10 dagen voor latere ligand wassen. 3C waarden zijn genormaliseerd naar tubuline en interactie frequenties tussen het anker-fragment en het fragment omvat het fragment β/HS waren ingesteld op nul. Foutbalken geven SD. n = 3. Dit cijfer is gewijzigd van aanvullende figuur 10 in Morgan, Stefanie L., et al.. 9. please click here to download dit cijfer. Aanvullende figuur 11: CLOuD9 constructies onherroepelijk koppelen in reactie op langdurige behandeling van ABA. Co-immunoprecipitations demonstreren onomkeerbare vereniging van de CSA en CSP dCas9 eiwitten na 10 dagen van ABA behandeling en 10 opeenvolgende dagen van ligand wassen. Dit cijfer is gewijzigd van aanvullende figuur 11 in Morgan, Stefanie L., et al.. 9. please click here to download dit cijfer. Aanvullende tabel 1: lijst van primer sequenties voor gRNAs, qRT-PCR, 3C en ChIP qPCR. Deze tabel is gewijzigd van aanvullende tabel 1 in Morgan, Stefanie L., et al.. 9. gelieve Klik hier om te downloaden van deze tabel
Discussion
The most kritische stappen in CLOuD9 chromatine looping zijn: 1) ontwerpen of met behulp van de juiste gRNAs, 2) veranderende media dagelijks op CLOuD9-getransduceerde cellen, met inbegrip van ABA of DMSO, 3) behoud van versheid van ABA, en 4) het uitvoeren van nauwkeurige en zorgvuldige beoordeling van chromatine bevleesdheid.
De grenzen van CLOuD9 bevinden zich voornamelijk in de mogelijkheid om het ontwerp van de gidsen voor de doel-regio van keuze. Gids RNAs de belangrijke taak van het lokaliseren van de componenten van de dCas9 tot doel DNA regio’s worden dimerized en de werkzaamheid van de gidsen zijn gebaseerd op hun specifieke doelsite. Zonder de juiste gRNA componenten geïnduceerde het systeem zal niet zitten kundig voor vormen omkeerbaar CLOuD9 lussen. Dus, door het ontwerpen van meerdere hulplijnen voor elk gebied van belang en de gidsen verspreiden over een gebied van 250-1000 bp, ten minste één succesvolle gids zal worden gezorgd. Gids locatie is ook integraal aan nauwkeurige resultaten. Het is belangrijk om te voorkomen dat gidsen gelegen in transcriptie factor bandplaatsen of andere kritieke gebieden om te voorkomen dat de effecten van de achtergrond zoals omhoog of omlaag regulering van de transcriptie. Bovendien kan de precieze locatie van de CLOuD9 constructie iets invloed transcriptie van het target-gen. Dit benadrukt het belang van het testen van meerdere paren van gidsen voor elk doel gebied, voor het identificeren van de meest robuuste paar voor experimentele doeleinden. Verder, in elk paar van doelregio’s, de CSA constructie moet worden gericht met gRNAs voor S. aureus, en de constructie van de CSP moet worden gericht met gRNAs voor S. pyogenes voor het targeten van specificiteit.
Om ervoor te zorgen nauwkeurige resultaten en juiste dimerisatie, is het ook belangrijk om de versheid van de cellulaire omgevingen na de transductie van de CLOuD9 constructies. Dagelijkse media wijzigen en de toevoeging van verse dimerizer (of besturingselement) zorgt ervoor dat de aanvullende constructies zal in de nabijheid blijven en behouden van de gewijzigde chromatine bevleesdheid. Bovendien is van essentieel belang voor het verkrijgen van authentieke resultaten garanderen de ABA is vers en op de juiste wijze is opgeslagen volgens de fabrikant protocol (geopend binnen 6 maanden, koud, beschermd tegen het licht gehouden).
Met name werd de ABA dimerizer voor CLOuD9 gebruikt met de ABI en PYL dimerisatie eiwitten, in plaats van de meer algemeen gebruikt FRB en FKBP systeem. De noodzaak van een rapalog voor het FRB/FKBP systeem zou hebben beperkt de toepasselijkheid van CLOuD9, als gevolg van de toxiciteit voor kankercellen. Het alternatieve systeem van de ABI/PYL omzeild deze beperking, effectief inschakelen van CLOuD9 als meer in het algemeen benutbare.
Gezamenlijk hebben we CLOuD9, een unieke en robuuste technologie die kan onder dwang, maar omkeerbaar maakt als volgt contactpersonen tussen luchtverontreiniging over lange afstand doel genomic loci ontwikkeld. Via inducerende chromatine lussen, we laten ook zien dat CLOuD9 kan worden gebruikt om wijzigen genexpressie in de juiste context van de cellulaire. Het aanpassingsvermogen van de technologie zorgt voor de onbeperkte studie van de interactie tussen elke twee genomic loci, zonder voorafgaande kennis van de regio’s in een lus of mechanismen in een lus. Bovendien kan CLOuD9 van unieke aantoonbare omkeerbaarheid verder onderzoek van de looping mechanismen in ziekte en ontwikkeling. Terwijl de gevolgen van de op-target van chromatine looping zijn duidelijk aangetoond, moet er nog worden gegevens bieden inzicht in de effecten van uit-target in een lus en de latere effecten op de lussen op de doelsoort.
Onze gegevens ziet u slechts een paar toepassingen van dit instrument, maar impliceert het belangrijke onderliggende idee dat chromatine regeling is een indicatie van de genexpressie. Onze technologie kan worden gebruikt om te studeren en onthullen de nuances van de structuur van de chromatine in genregulatie, waardoor het algemene begrip van de rol van de chromatine vouwen in de transcriptie van genen. Een beter begrip van de subtiliteiten van transcriptionele dynamiek kan het voortouw nemen in onderzoek en behandeling van kanker, erfelijke ziekten en aangeboren aandoeningen, in welke verschillende chromatine Vergadering ongetwijfeld gen expressie20verandert, 21,22,23. Latere werk met behulp van de CLOuD9 technologie zal verlichten verdere details over de regeling en de dynamiek van de chromatine domeinen en hoe ze rijden vouwen om stabiele genexpressie in zowel de ontwikkeling als de ziekte.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken H. Chang, T. Oro, S. Tavazoie, R. Flynn, P. Batista, E. Calo en het gehele Wang laboratorium voor technische ondersteuning en kritische lezing van het manuscript. S.L.M. heeft gesteund in dit werk via de NSFGRF (DGE-114747), NDSEGF (FA9550-11-C-0028) en het National Cancer Institute (1F99CA222541-01). K.C.W. wordt ondersteund door een Career Award voor medische wetenschappers uit het Burroughs-Wellcome-Fonds, en is een Donald E. en Delia B. Baxter Stichting faculteit geleerde.
Materials
| RPMI 1640 media | Life Technologies | 11875-119 | For K562 cell culture |
| DMEM media | Life Technologies | 11995-065 | 1X, for 293T cell culture |
| lentiCRISPR v2 | Addgene plasmid | #52961 | For CLOuD9 plasmid development |
| pRSV-Rev | Addgene plasmid | #12253 | For lentivirus production |
| pMD2.G | Addgene plasmid | #12259 | For lentivirus production |
| pMDLg/pRRE | Addgene plasmid | #12251 | For lentivirus production |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668-019 | For lentivirus production |
| anti-HA antibody | Cell Signaling | 3724 | For immunoprecipitation |
| anti-Flag antibody | Sigma | F1804 | For immunoprecipitation |
| DNeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For DNA extraction |
| TRIzol | Life Technologies | 15596-018 | For RNA extraction |
| RNeasy Kit | Qiagen | 74106 | For RNA extraction |
| Superscript VILO | Life Technologies | 11754-050 | For cDNA |
| SYBR Green I MasterMix | Roche | 4707516001 | For qPCR analysis |
| Light Cycler 480II | Roche | For qPCR analysis | |
| anti-H3K4me3 antibody | AbCam | ab8580 | For ChIP-qPCR |
| anti-RNA Pol-II antibody | Active Motif | 61083 | For ChIP-qPCR |
| EDTA free protease inhibitor | Roche | 11873580001 | For protein extraction |
| 4-12% Tris Glycine gel | Biorad | Any size, For western blot | |
| anti-Rabbit HRP antibody | Santa Cruz | sc-2030 | For western blot |
| anti-mouse HRP antibody | Cell Signaling | 7076S | For western blot |
| K562 and H3K293 ChIP-Seq data | Encode | ENCSR000AKU | For ChIP-seq analysis |
| K562 and H3K293 ChIP-Seq data | Encode | ENCSR000APE | For ChIP-seq analysis |
| K562 and H3K293 ChIP-Seq data | Encode | ENCSR000FCJ | For ChIP-seq analysis |
| K562 and H3K293 ChIP-Seq data | GEO | GSM1479215 | For ChIP-seq analysis |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Thermo Fisher Scientific | 10001D | For immunoprecipitation |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Thermo Fisher Scientific | 10004D | For immunoprecipitation |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | For RNA purification |
| Pierce 16% Formaldehyde Methanol-free | Thermo Fisher Scientific | 28908 | For crosslinking |
| PX458 Plasmid | Addgene | 48138 | Suggested active Cas9 plasmid for gRNA cloning, but any active Cas9 plasmid will do |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | For PCR purification |
| FastDigest BsmBI | Thermo Fisher Scientific | FD0454 | For cloning guide RNAs |
| FastAP | Thermo Fisher Scientific | EF0651 | For cloning guide RNAs |
| 10X FastDigest Buffer | Thermo Fisher Scientific | B64 | For cloning guide RNAs |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For cloning guide RNAs |
| 10X T4 Ligation Buffer | NEB | B0202S | For cloning guide RNAs |
| T4 PNK | NEB | M0201S | For cloning guide RNAs |
| 2X Quick Ligase Buffer | NEB | B2200S | For cloning guide RNAs |
| Quick Ligase | NEB | M2200S | For cloning guide RNAs |
| Buffers | |||
| Farnham lysis buffer | 1% Tris-Cl pH 8.0, 1% SDS, 1% protease inhibitor water solution (non-EDTA), and 1 mM EDTA in water | ||
| Modified RIPA buffer | 1% NP40/Igepal, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, and 1% protease inhibitor water solution (non-EDTA) in PBS pH 7.8 or 7.4 | ||
| IP dilution buffer | 0.01% SDS, 1.1% Triton-X 100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris-HCl pH 8.0, 167 mM NaCl, 0.1x protease inhibitor | ||
| Wash buffer | 100 mM Tris pH 9, 100 mM LiCl, 1% NP-40, and 1% sodium deoxycholate | ||
| Swelling buffer | 0.1 M Tris pH 7.5, 10 mM potassium acetate, 15 mM magnesium acetate, 1% NP-40 | ||
| Dilution buffer | 0.01% SDS, 1.1% Triton X-100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris pH 8 and 167 mM NaCl | ||
| IP elution buffer | 1% SDS, 10% NaHCO3 |
References
- Krivega, I., Dean, A. Chromatin looping as a target for altering erythroid gene expression. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1368, 31-39 (2016).
- Matharu, N., Ahituv, N. Minor loops in major folds: Enhancer-promoter looping, chromatin restructuring, and their association with transcriptional regulation and disease. PLoS Genet. 11, e1005640 (2015).
- Dekker, J., Martí-Renom, M. A., Mirny, L. A. Exploring the three-dimensional organization of genomes: interpreting chromatin interaction data. Nat. Rev Genet. 14, 390-403 (2013).
- Kim, A., Dean, A. Chromatin loop formation in the b-globin locus and its role in globin gene transcription. Mol Cells. 34, 1-5 (2012).
- Petrascheck, M., et al. DNA looping induced by a transcriptional enhancer in vivo. Nucleic Acids Res. 33, 3743-3750 (2005).
- Ameres, S. L., et al. Inducible DNA-loop formation blocks transcriptional activation by an SV40 enhancer. EMBO J. 24, 358-367 (2005).
- Deng, W., et al. Controlling Long-Range Genomic Interactions at a Native Locus by Targeted Tethering of a Looping Factor. Cell. 149, 1233-1244 (2012).
- Deng, W., et al. Reactivation of developmentally silenced globin genes by forced chromatin looping. Cell. 158, 849-860 (2014).
- Morgan, S. L., et al. Manipulation of Nuclear Architecture through CRISPR-Mediated Chromosomal Looping. Nature Communications. 8, (2017).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17 (1), 148 (2016).
- . . Lipofectamine 2000 Reagent. , (2013).
- . . DNeasy Blood & Tissue Kit Handbook. , (2006).
- . . Determining Genome Targeting Efficiency using T7 Endonuclase I (M0302). , (2016).
- Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods Mol Biol. 649, 247-256 (2010).
- Shalem, O., Sanjana, N. E., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. , 83-87 (2014).
- . . RNeasy Mini Handbook. , (2012).
- . . SuperScript VILO cDNA Synthesis Product Information Sheet. , (2015).
- Theunissen, T. W., et al. Systematic identification of culture conditions for induction and maintenance of naive human pluripotency. Cell Stem Cell. 15, 471-487 (2014).
- Mokry, M., et al. Integrated genome-wide analysis of transcription factor occupancy, RNA polymerase II binding and steady state RNA levels identify differentially regulated functional gene classes. Nucleic Acids Res. 40, 148-158 (2012).
- Drier, Y., et al. An oncogenic MYB feedback loop drives alternate cell fates in adenoid cystic carcinoma. Nat Genet. 48, 265-272 (2016).
- Ryan, R. J. H., et al. Detection of enhancer-associated rearrangements reveals mechanisms of oncogene dysregulation in B-cell lymphoma. Cancer Discov. 5, 1058-1071 (2015).
- Montavon, T., et al. A regulatory archipelago controls Hox genes transcription in digits. Cell. 147, 1132-1145 (2011).
- Lupianez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161, 1012-1025 (2015).
Cite This Article
Morgan, S. L., Chang, E. Y., Mariano, N. C., Bermudez, A., Arruda, N. L., Wu, F., Luo, Y., Shankar, G., Huynh, S. K., Huang, C., Pitteri, S. J., Wang, K. C. CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure. J. Vis. Exp. (139), e57457, doi:10.3791/57457 (2018).