שיטות משלוח כפול גדילי RNA אוראלי לזירוז התערבות RNA שיפה וחרקים Hemipteran צמח sap-האכלה

חרקים hemipteran מהווים חלק המזיקים ביותר מבחינה כלכלית משמעותית של agriculturebecause יכולתם להשיג גידול האוכלוסייה מוגברות ולהפיץ מחלות בצמחים. BMSB, ח’ האליס פלדה, הוא המזיק פולשני זה הוצג בטעות עם גילויו הראשון דיווחה בשנת 1996¹בחצי הכדור המערבי ב אלנטאון פנסילבניה מאסיה (סין, טייוואן, קוריאה ויפן). מאז השקתו, BMSB זוהה 43 מדינות, עם האוכלוסיות הגבוהה ביותר באוקיינוס האטלנטי (דה, MD, הרשות הפלסטינית, NJ, אמפר, ו WV), כמו גם בקנדה ובארצות אירופה, והוא מייצג איום פוטנציאלי על החקלאות². כמו מטרד רב, BMSB יכול לעורר נזק למארחים כ 300 צמחים מוכרים, כולל ערך גבוה גידולים כגון תפוחים, ענבים, צמחי נוי, זריעה, סויה, תירס. נזק נגרם בעיקר בשל המצב של האכלה המכונה lacerate, סומק שם החיה מפלח את היבול מארח עם שלו stylet דמוי מחט כדי לקבל גישה אל החומרים המזינים רקמות וסקולריים^2,3. BMSB הוא גם המזיק מקורה כמו הם עשויים למצוא מגורים באזורי מגורים כגון בתי ספר, בתים במהלך סתיו חורף². כימיקלים, aeroallergens שפורסמו על ידי BMSB דווחו על תגובה אלרגית איליקיט עובדים חיתוך פירות. BMSB עשוי גם לתרום למחלות אלרגיות שמוביל ממגע, דלקת הלחמית דלקת אנשים רגישים^4,5. עוד חרק hemipteran, ACP, קמחית ד Kuwayama (פשפשאים: Liviidae), היא מטרד רציני של פירות הדר, ומעבירה את החיידקים שיפה מוגבל (טיריה LiberibacterCandidatus ) גורמת Huanglongbing (HLB), הידוע יותר כמו מחלת ירוק הדר^6,7. HLB דווחה לראשונה מסין הדרומית, התפשט 40 שונים אסיה אפריקה, האוקיאנית, דרום, צפון אמריקה מדינות⁷. ירוק הדר היא בעיה ברחבי העולם עם איום כלכלי הפסדים בשל אובדן פרי הדר; לפיכך, הנהלת ACP נחשב בעל חשיבות עליונה כדי למנוע ולשלוט HLB.

האמצעים לבקרה יעילה של מזיקים חרקים אלו בדרך כלל דורש היישום של הדברה כימית קצרות יחסית חי. הדברה כימית אסטרטגיות שליטה לעיתים קרובות חוסר אסטרטגיות ניהול הסביבה בטוח או פחתו הרגישות עקב עמידות לחומרי הדברה הדברה אוכלוסיות^8,9. לפיכך, הדברה ביולוגית של מזיקים עם biopesticides מולקולרית היא חלופה אפשרית, אבל השימוש בה באופן גלובלי נשאר צנוע, מינים שונים של צירעת האפידיוס (למשל, Trisolcus ג’אפוניכאס) יכול להיות גם יעיל כמו ביולוגית טבעית פקדים. RNAi הוא פוטנציאל המתעוררים טכנולוגיות לניהול פולשנית חרקים מזיקים עם biopesticides מולקולרית¹⁰. RNAi היא מנגנון רגולטורי ג’ין תיאר היטב מקלה את יעילות posttranscriptional ג’ין להחרשת של אנדוגני כמו גם פולשים dsRNAs באופן ספציפי רצף, שמוביל בסופו של דבר בקרת גנים ב mRNA רמה^11,12. בקצרה, כאשר dsRNA אקסוגני הוא הפנימו לתא שזה שהוא מעובד siRNAs על-ידי חבר superfamily RNase השלישי נוקלאז bidentate, נקרא לטעמים, אשר אבולוציונית כולו בתולעים זבובים, צמחים, פטריות, יונקים^{13, 14 , 15}. אלה דופלקסים siRNA נוקלאוטיד 21-25 ואז לשחרר ממנו, משולב בתוך המתחם שתיקה RNA-induced (RISC) כמו מדריך RNAs. מתחם RISC-RNA זה מאפשר זיווג הבסיס של ווטסון-קריק ל משלימים היעד mRNA; זה מוביל בסופו של דבר המחשוף של החלבון Argonaute, תחום רב חלבון המכיל תחום RNase H דמוי, אשר מדרדרת את ה-mRNA המתאימים ומפחית תרגום החלבון, ובכך מוביל ג’ין posttranscriptional להשתיק^{16 , 17 , 18}.

RNAi לניהול הדברה מחייבת המבוא של dsRNA ויוו להשתיק את הגן של עניין, ובכך הפעלת מסלול siRNA. שיטות שונות בהן השתמשו למסירה dsRNA חרקים, חרקים תאים לזירוז RNAi מערכתית כוללת האכלה^10,19, טבילה^20,21, microinjection²², נשאים כגון ליפוזומים ²³, טכניקות אחרות²⁴. RNAi היה הראשון הפגינו Caenorhabditis elegans להשתיק unc-22 גנים מאש מלו²⁵, ואחריו נוקאאוט ביטוי של גנים עלי דרוזופילה melanogaster²⁶. מחקרים ראשוניים פונקציונלי מנוצל microinjection כדי לספק dsRNA חרקים, כגון בומבוס^22,27, Acyrthosiphon אפון²⁸, במיוחד גרמנית²⁹, האליס ה³⁰, וחרקים lepidopteran (נבדקה על ידי. Terenius et al. ³¹). microinjection יש יתרון לספק מנה ומדויקים לאתר של עניין החרק. אמנם דקירות ספיגה כזה עשוי להפיק ביטוי של גנים הקשורים החיסון עקב טראומה³², לפיכך, שוללים את המעשיות שלה בפיתוח חקלאי biopesticides.

שיטה נוספת להעברת dsRNA ויוו היא למסמס, אשר כרוך בליעה או קליטה של dsRNA מאת השעיה של חיות או תאים בדרך כלל במדיום חוץ-תאית שמכילה dsRNA. השריית שימש לזירוז ביעילות RNAi בתאים תרביות רקמה דרוזופילה S2 לעכב במורד הנחל-של-Raf1 (DSOR1) מופעל mitogen חלבון קינאז קינאז (MAPKK)²⁰, כמו גם ב- C. elegans להשתיק את pos-1 ג’ין³³. אולם, dsRNA מועברת באמצעות השריית היא פחות יעילה לזירוז RNAi בהשוואה microinjection²⁰. RNAi בתיווך מצרי להשתיק בחרק הלעיסה הוצג לראשונה rootworm תירס המערבי (WCR) (Diabrotica virgifera virgifera) על ידי הלוגיסטים של dsRNA לתוך דיאטה אגר מלאכותי¹⁰. דו חות קודמים יש סיכם שיטות לאספקת dsRNA חדורים בתזונה טבעית ספיציפית פרוקי רגליים³⁴. שיטות משלוח אלה נקבעו עוד יותר יעיל וזהובה באמצעים מלאכותיים מסירה; כמו במקרה של זבובים (Glossina morsitans morsitans), שבו שווה נוקאאוט הגנים הקשורים החיסון נצפתה כאשר dsRNA נמסרה או באמצעות ארוחת דם או microinjected³⁵. באופן דומה, משלוח של dsRNA דרך טיפות תפוח חום בהיר עש (Epiphyas postvittana)³⁶, הזחלים diamondback עש (Plutella xylostella)³⁷, כמו גם דבש דבורים^38,39 המושרה RNAi יעיל. ניסויים RNAi היעילה ביותר hemipteran נעזרו הזרקה של dsRNA⁴⁰ כי משלוח אוראלי של dsRNA בחרקים hemipteran מפרך מאז שצריכים להישלח דרך רקמות וסקולריים של הצמח הפונדקאי. RNAi יעיל נצפתה גם ACP, צלף מזוגגות-כנף leafhopper (GWSS), Homalodisca vitripennis: dsRNA נמסר דרך הדרים וגפנים שקלטה dsRNA לרקמות וסקולריים דרך השורש הירטבות, בריסוס תרסיסים, תא המטען זריקות או הספיגה על ידי ייחורים^{41,42,43,44,45,46}. זה הביא גם הפטנט הראשון על dsRNA נגד ACP (2016, לנו 20170211082 A1). משלוח של siRNA ו dsRNA באמצעות נשאים כגון חלקיקים, ליפוזומים מקנה יציבות, העלאות dsRNA ונמסרו יעילות במהירות מתגלים^{23,47,48,49 ,50}. מחלקה חדשה של כלי רכב מבוססי ננו-חלקיק משלוח עבור חומצות גרעין במבחנה , ויוו היה מסוכם במיוחד עבור יישומים טיפוליים שעשוי להקנות פוטנציאל עצום כמו צורת המשלוח המומנט⁵¹. חלקיקים כרכב משלוח עבור dsRNA אולי חסרונות כולל מסיסות, hydrophobicity או bioaccumulation מוגבלת⁵², אבל משלוח עזר פולימר מתאים עשוי לפצות את החסרונות. פיתוח ושימוש עצמי להעברת נוקלאוטידים מתגלים גם בשם ‘antisense oligonucleotides’, אשר בודד נטושים RNA/DNA דופלקסים⁴⁶.

Vitellogenesis של פרוקי רגליים הוא מפתח תהליך השליטה רבייה ומוסדרת על ידי הורמון נעורים (JH) או ecdysone, אשר הם inducers מפתח של סינתזה Vg מאת שומן הגוף; Vg הוא נלקח בסופו של דבר על ידי oocyte לפתח דרך Vg-קולטן בתיווך מצרי-אנדוציטוזה-⁵³. Vg היא קבוצה של polypeptides מסונתז extraovarially, שהיא הכרחית להתפתחות של החלבון חלמון ביצה גדולה,^54,vitellin⁵⁵, לכן חשוב רבייה, הזדקנות⁵⁶. Vg הושתקה בהצלחה בנמטודות⁵⁷ , כמו גם בדבורת הדבש (בומבוס) איפה RNAi בתיווך מצרי דלדול של Vg נצפתה מבוגרים וביצים²². RNAi בתיווך posttranscriptional ג’ין להחרשת Vg נבדקה מכיוון שהאמינה שדלדול שלה יוביל אפקט פנוטיפי הנצפה כגון מופחתת פוריות ופריון, פוטנציאל לסייע בשליטה BMSB. הגן JHAMT מקודד את S-adenosyl-L-מתיונין (SAM)-תלוי JH חומצה O-methyltransferase, מזרז את השלב הסופי של מסלול ביוסינטזה JH⁵⁸. ב- farnesyl מסלול זה רב-תכליתי (FPP) ברצף כשהופכים מן farnesol, חומצה farnesoic, ואחריו ההמרה של מתיל farnesoate JH על-ידי JHAMT. מסלול זה כולו חרקים, פרוקי רגליים במיוחד עבור מטמורפוזה, תהליך התפתחותי מוסדר על ידי הורמונים-^59,–^60,–⁶¹. ב מורי דרב, ביטוי גנים JHAMT ואת הפעילות biosynthetic הוחלף נגזר JH allata הקורפוסים מראים כי הדיכוי תעתיק של הגן JHAMT הוא קריטי עבור הסיום של JH ביוסינטזה⁵⁸. לכן, הגנים JHAMT ו- Vg נבחרו עבור דלדול ממוקד באמצעות RNAi. RNAi נבחנה גם עצי הדר על השליטה ACP ו- GWSS. עצי הדר שטופלו dsRNA דרך השורש הירטבות, הגבעול הקשה (המטען זריקות), כמו גם בריסוס תרסיסים עם dsRNAs נגד חרקים ארגינין ספציפי קינאז (אי קאי) תעתיקים^42,44. יישום אקטואלי של dsRNA זוהה על החופה של עצי הדר, המציין משלוחים יעיל דרך הרקמות צמחים עילאיים, וכתוצאה תמותה מוגברת ACP, GWSS^{41,42, 45}.

במחקר הנוכחי, זיהינו שיטת משלוח דיאטה טבעית עבור טיפולים כגון dsRNA. טכניקה זו פיתח שימש לאחר מכן להשתיק את JHAMT ואת Vg mRNA באמצעות גנים ספציפיים dsRNAs ב BMSB נימפות כמו הפגינו קודמות⁶². פרוטוקולים אלה-משלוח חדש המודגמות כאן מחליף קונבנציונאלי מערכות אספקה RNA המשתמשות תרסיסים אקטואלי או microinjections. ירקות, פירות, גזע הקשה אדמה קפה, ופעולות חימר. סופגים ב עשוי לשמש עבור משלוח של dsRNA, אשר הינה קריטית להמשך התפתחותו של המזיק biopesticide וניהול הפתוגן.