Методы доставки двуцепочечной РНК Оральный побудить РНК-интерференции в флоэма и членистохоботные насекомых, растений sap питание

Членистохоботные насекомые составляют некоторые из наиболее экономически значимых вредителей agriculturebecause их способности для достижения повышенных населения роста и распространения заболеваний растений. BMSB, Stål H. щитомордник , является инвазивным Пешт, который был случайно введен в Западном полушарии в Аллентаун, Пенсильвания из Азии (Китай, Тайвань, Корея и Япония) с первой прицельной, сообщили в 1996 году¹. С момента своего появления BMSB была обнаружена в 43 государствах, с высоким населения в Срединно-Атлантического (DE, MD, Пенсильвания, Нью-Джерси, VA и WV), а также в Канаде и Европе и представляет собой потенциальную угрозу для сельского хозяйства². Как полифаговый Пешт BMSB может спровоцировать повреждение примерно 300 узлов выявленных растений, включая высокотоварных культур, таких как яблоки, виноград, декоративных растений, семян сельскохозяйственных культур, сои и кукурузы. Повреждение вызвано главным образом из-за режима кормления, известный как lacerate и изобилия, где животное пронзает принимающей культур с его игольчатые стилет, чтобы получить доступ к питательные вещества от сосудистых тканей^2,3. BMSB является также крытый вредителей, как они могут найти проживание в жилых помещениях, таких как школы и дома в течение осени через зимний². Химические вещества и аэроаллергенами, выпущенная BMSB сообщалось незаконным аллергическая реакция в фруктовых культур работников. BMSB может также способствовать аллергических заболеваний, ведущих к контактный дерматит, конъюнктивит и ринита в чувствительных людей^4,5. Еще один членистохоботные насекомых, акт, D. citri Кувейама (полужесткокрылые: Liviidae), является серьезным вредителем цитрусовых и передает флоэма ограниченной бактерий (Candidatus Liberibacter Азиатская), вызывая Huanglongbing (HLB), более известный как цитрусовые, озеленение болезни^6,7. HLB впервые сообщили из Южного Китая и распространился на 40 различных Азии, Африки, Океании, Южной и Северной Америки стран⁷. Цитрусовые озеленение является проблемой во всем мире с угрожающими экономических и финансовых потерь из-за потери цитрусовые; Следовательно управление акт считается крайне важное значение для предотвращения и контроля HLB.

Меры для эффективного контроля за этих насекомых-вредителей, как правило, требует применения химических пестицидов, которые являются относительно короткими жили. Стратегии контроля химических инсектицидов часто не хватает стратегий безопасного управления природопользованием или уменьшилась подверженность из-за сопротивления пестицидов в Пешт населения^8,9. Следовательно биологического контроля вредителей с молекулярной биопестицидов потенциальной альтернативой, но его использование глобально остаются скромными, и различных видов гемоцитов (например, Trisolcus japonicus) также может быть эффективным как естественных биологических элементы управления. RNAi является потенциал новых технологий для управления инвазивных насекомых-вредителей с молекулярной биопестицидов¹⁰. RNAi это хорошо описана гена регулирующий механизм, который облегчает эффективное посттранскрипционного гена глушителей эндогенных а также вторжение двуцепочечных РНК в последовательность конкретным образом, что в конечном итоге приводит к регуляции экспрессии генов в мРНК ¹²уровень^11,. Кратко когда экзогенных dsRNA внедрено в ячейку, которую она перерабатывается в малые интерферирующие РНК членом надсемейства бидентантный Нуклеаза РНКазы III, называемый Dicer, который эволюционно сохраняется в черви, мух, растений, грибов и млекопитающих^{13, 14 , 15}. Эти 21-25 нуклеотидов siRNA дуплексы, затем раскрутил и интегрированы в РНК-комплекс (RISC) как руководство РНК. Этот комплекс RISC-РНК позволяет Уотсона-крика низкопробный спаривать для дополнительных целевых мРНК; Это в конечном итоге приводит к расщепления белков Argonaute, multi домен белка, содержащего РНКазы H-как домен, который ухудшает соответствующей мРНК и уменьшает перевод белка, что ведет к посттранскрипционного гена, глушителей^{16 , 17 , 18}.

РНК-интерференции для борьбы с вредителями требует введением dsRNA в vivo заставить замолчать гена интереса, тем самым активизируя путь siRNA. Различные методы, используемые для доставки dsRNA насекомых и насекомых клетки побудить системных RNAi включают в себя питание^10,19, замачивания^20,21, микроинъекции²², перевозчиков например липосом ²³и другие методы²⁴. RNAi была впервые продемонстрирована в Caenorhabditis elegans замолчать экспрессии генов unc-22 огнем и Мелло²⁵, следуют нокдаун в выражении Кучерявая генов в Drosophila melanogaster²⁶. Первоначальный функциональные исследования использовали микроинъекции доставить двуцепочечной ДНК в насекомых, таких как Apis mellifera^22,27, Гороховая pisum²⁸, германский Blattella²⁹, H. щитомордник³⁰и спаривающиеся насекомых (обзор, Terenius и др. ³¹). микроинъекции выгодно для доставки и точное доза на сайт интерес в насекомых. Хотя такой септик проколы могут выявить выражение иммунной связанных генов из-за травмы³², следовательно, исключает ее практичность в развитии сельскохозяйственной биопестицидов.

Другой метод доставки двуцепочечной ДНК в естественных условиях является путем замачивания, который включает в себя заглатывания или поглощение dsRNA подвеска животных или клетки обычно в внеклеточной среде, содержащей двуцепочечной ДНК. Замачивания использовалась эффективно побудить RNAi дрозофилы S2 клетки культуры ткани подавляют Downstream Raf1 (DSOR1) Митоген активированный протеин киназы киназы (MAPKK)²⁰, а также в C. elegans заставить замолчать POS-1 гена³³. Однако малым интерферирующим РНК, доставляются с помощью замачивания является менее эффективным, чтобы побудить интерференции, по сравнению с микроинъекции²⁰. RNAi опосредованного подавления в жевательной насекомых был впервые показан в Западный кукурузный rootworm (WCR) (под эгидой содействие), вливая двуцепочечной ДНК в искусственных агар диета¹⁰. Предыдущих докладах обобщили методов доставки вливается в природных диеты для членистоногих³⁴двуцепочечной ДНК. Эти методы доставки далее были полны решимости быть соответствующе эффективно искусственных средств его доставки; Например, в случае мухи цеце (Glossina morsitans morsitans), где равных нокдаун гена, связанные с иммунной наблюдалось, когда двуцепочечной ДНК был доставлен через крови еды или microinjected³⁵. Аналогичным образом доставка двуцепочечной ДНК через капли в светло коричневый яблоко моли (Epiphyas postvittana)³⁶, бугорчатая моли (Plutella xylostella) личинки³⁷, а также мед пчелы^38,39 индуцированных эффективное RNAi. Наиболее эффективное RNAi эксперименты в членистохоботные использовали инъекции dsRNA⁴⁰ , потому что устные доставка двуцепочечной ДНК в членистохоботные насекомых является трудной, поскольку оно должно быть доставлено через сосудистых тканей растения-хозяина. Эффективное RNAi наблюдалось также в АШП и стекловидный крылатый снайпер Цикадки (GWSS), Homalodisca vitripennis: двуцепочечной ДНК был доставлен через цитрусовых и виноградные лозы, которые поглощены двуцепочечной ДНК в сосудистых тканей через корень обливать, листвы аэрозоли, ствол инъекции или поглощением черенки^{41,42,,4344,45,46}. Это также привело к первый патент для dsRNA против ACP (2016, нас 20170211082 A1). Доставка малых интерферирующих РНК и малым интерферирующим РНК с помощью перевозчиков например наночастиц и липосомы придает стабильность, и увеличение эффективности поставляемого dsRNA быстро появляются^{23,47,48,49 ,50}. Новый класс автомобилей доставки на основе наночастиц для нуклеиновых кислот в пробирке и в естественных условиях , было кратко специально для терапевтического применения могут распространять огромный потенциал как подходящие доставки векторные⁵¹. Наночастицы как средство доставки для двуцепочечной ДНК могут иметь недостатки, включая растворимость, гидрофобность или ограниченный биоаккумуляции⁵², но подходящего полимерного пособничестве доставки может компенсировать эти недостатки. Разработка и использование самостоятельно доставлять нуклеотидов появляются также называется «антисмысловых олигонуклеотидов», которые являются одной мель РНК/ДНК дуплексы⁴⁶.

Vitellogenesis в членистоногих является одним из ключевых процессов управления воспроизведением и регулируется несовершеннолетних гормонов (JH) или экдистероидов, которые являются ключевыми индукторов Vg синтеза жира; в конечном итоге Vg поглощается развивающихся ооцитов через вол рецептор-опосредованный эндоцитоз⁵³. VG-группы полипептиды синтезированы extraovarially, который имеет важное значение для развития основных яичный желток белка, vitellin^54,55, и поэтому важно воспроизведение и старения⁵⁶. VG был успешно замолчать в нематод⁵⁷ , а также в медоносной пчелы (Apis mellifera) где истощение Vg опосредованного интерференции наблюдался в²²взрослых и яйца. Интерференции, протестированных опосредованного посттранскрипционного гена глушителей из Vg был потому что считалось, что его истощении приведет к наблюдаемый фенотипические эффект таких, как снижение плодородия и плодовитости, потенциально помощи в BMSB управления. JHAMT ген, который кодирует S-аденозил L-метионина (SAM)-зависимых JH кислоты O-метилтрансфераза, катализирует заключительный этап пути биосинтеза JH⁵⁸. В этом пути Фарнезилпирофосфат пирофосфат (FPP) последовательно преобразуется из фарнезол, farnesoic кислота, следуют преобразование метил farnesoate JH, JHAMT. Этот путь сохраняется в насекомых и членистоногих специально для метаморфоза, процесс, который регулируется развивающих гормоны^59,,6061. В б. МориJHAMT экспрессии генов и биосинтетическую активность JH в кавернозных Тегулы предположить, что transcriptional подавление гена JHAMT имеет решающее значение для прекращения JH биосинтез⁵⁸. Таким образом гены JHAMT и вол были отобраны для целевых истощения, с помощью РНК-интерференции. RNAi также был испытан в цитрусовых деревьев для управления АКП и GWSS. Цитрусовые деревья были обработаны с двуцепочечной ДНК через корень обливать, стволовые кран (ствол инъекции), а также Внекорневые спреи с двуцепочечных РНК против насекомых конкретных аргинин киназы (АК) стенограммы^42,44. Актуальным применение двуцепочечной ДНК была обнаружена всему сенью цитрусовых деревьев, указывающее эффективной доставки через сосудистых тканей растений и привели к росту смертности в АШП и GWSS^,41–^{42, 45}.

В текущем исследовании мы определили метод доставки естественная диета для лечения таких двуцепочечной ДНК. Впоследствии этот недавно разработанный метод использовался для подавления JHAMT и вол мРНК, используя гена конкретных двуцепочечных РНК в нимфы BMSB как показано ранее⁶². Эти новые протоколы доставки, продемонстрировали здесь отменяют обычных систем доставки РНК, использующих актуальные аэрозоли или микроинъекций. Овощи и фрукты, стволовые кран, обливая почвы и глиняные адсорбенты в может использоваться для доставки двуцепочечной ДНК, которая имеет решающее значение для дальнейшего развития биопестицидов вредителей и патогенных управления.