Summary

마우스 작은 장의 면역 시스템에서 세포를 분리

Published: February 28, 2018
doi:

Summary

여기 창 자 연관 된 림프 조직 Peyer의 패치 및 배수 mesenteric 림프절을 포함 하 여 유도 사이트와 lamina propria 포함 이펙터 사이트에서 세포의 고립에 대 한 자세한 프로토콜 설명 및 작은 장 면역 시스템의 장 상피입니다.

Abstract

장의 면역 시스템 enteropathogenic에 대 한 효과적인 면역 응답을 설치 하는 동안 식이 항 및 공생 박테리아 허용 응답을 생성 하 여 위장의 장벽 기능 유지에 중요 한 역 미생물입니다. 또한, 그것은 분명 지역 장 면역 먼 및 조직의 면역에 깊은 영향을가지고 되었다. 따라서, 그것은 장 면역 반응을 유도 하는 어떻게 무엇 이며 응답의 면역학 결과 공부 하는 것이 중요입니다. 여기, 상세한 프로토콜 창 자 연관 된 림프 조직 Peyer의 패치 및 배수 mesenteric 림프절 같은 소장 유도 사이트와 lamina propria 같은 이펙터 사이트에서 세포의 고립에 대 한 설명 및 장 상피입니다. 이 기술은 최적의 순도 및 생존 능력 허용 시간 범위 내에서 최소한의 상호 compartmental 오염 작은 창 자 조직에서 세포의 많은 수의 격리를 보장합니다. 세포 및 장 조직에서 다른 면역 세포 분리 기술 기능 위장 감염, 암, 염증 성 질환에 면역 반응의 이해를 수 있습니다.

Introduction

위장 (GI)는 많은 주름 돌출 외부 환경과 내부 신체 분리 큰 인터페이스를 나타내는 있다. 장의 면역 시스템 기 관의 장벽 기능 유지에 필수적인 역할을 한다. 그것은 끊임없이 식이 항, 공생 박테리아 및 병원 성 미생물에 노출 됩니다. 이와 같이, 음식 항 원 및 공생 박테리아 관용 있어야 합니다 빠르게 enteropathogenic 미생물1에 대 한 효과적인 면역 응답을 생성 하는 능력을 유지 하면서. 장의 면역 시스템 해부학 어디 순진한 림프 톨 항 원 장 점 막에서 항 원을 운반 하는 세포에 의해 활성화 됩니다, 유도 사이트 및 이펙터 사이트, 활성화 된 림프 톨 특정 발휘로 분할 될 수 있다 이펙터 기능2. 유도 사이트 구성 조직된 림프 구조에 Peyer의 패치 (PP)의 전문된 M 세포와 지역 배수 mesenteric 림프절 (MLN)의 행동을 통해 직접 창 자 루멘을 조사. 이펙터 사이트 lamina propria (LP), 지하실 멤브레인와 장 상피 세포, intraepithelial 세포 (IEL)를 포함 하는 지하실 멤브레인 위에 있는 단일 셀 레이어 아래 결합 조직으로 구성 됩니다. 세포는 적응 면역의 주요 플레이어는 감염 및 암에 대 한 보호를 중재 하 고 염증 성 질병에 immunopathology에도 기여할 수 있습니다. 그것은 중요 한 고이 고유에 세포를 공부 하는 관련성이 높은 해 부 점 막 구획을 더 나은 이해 그들의 유도 및 이펙터 기능.

소장에 발생 하는 면역 이벤트를 탐험 하는 수 사관의 수는 가속으로 비교적 간단 하 고 통합 프로토콜 이러한 구획에서 세포의 고립에 대 한 필요 합니다. 여러 연구 그룹 출판 마우스 작은 창 자 구획3,,45,6,7에서에서 면역 세포를 분리 하는 데 몇 가지 유사한 프로세스를 공유 하는 프로토콜 . 그러나, 개별 프로토콜의 초점에 따라 그들 가운데 몇 가지 기술적 차이가 있습니다. 예를 들어 LP에서 면역 세포를 분리 하는에 초점을 맞추고, 한 프로토콜 세포 생존 능력, 세포 표면 마커 식, 그리고 고립 된 면역 세포5의 구성에 다양 한 효소 소화에 미치는 영향을 검사 합니다. 다른 프로토콜 밀도 원심 분리6없이 세포의 고립에 대 한 신속 하 고 재현성 방법을 강조 한다. 마지막으로, 특정 프로토콜 또한 작은 창7의 다른 조직 층에서 단 식 세포를 고립 시키기 위해 존재 한다. 여기, 소장의 MLN, PP, LP, 및 IEL 구획에서 림프 구 인구의 순차적 격리를 허용 하는 높은 재현 프로토콜 제공 됩니다.

우리는 크게 다른 장의 구획에서 오염 물질의 무료 LP 및 IEL 구획에서 높게 순화 된 인구를 고립 시키기에 초점. 이 널리 사용 프로토콜 생산 허용 시간 제약4,8,9,10,,1112에서 극대로 순수 하 고 실행 가능한 세포의 높은 수확량. 이 프로토콜 또한 타고 난 기회가 뚜렷한 구획에 세포 공부를 수 있도록 최소한의 크로스 compartmental 오염 LP 및 IEL 구획에서 림프 톨의 격리를 보장 합니다. 고립 된 세포 흐름 cytometric 분석 또는 기능 분석 같은 추가 조작 대상이 될 수 있습니다. 이 프로토콜 성공적으로 적용 된 세포의 고립에 마우스 작은 창 자와 콜론에서 Listeria monocytogenes, 살 모 넬 라 typhimurium, 페스트 pseudotuberculosis 등 세균 감염 시 감염 그리고 화학 및 병원 체 유발 장 염 등 염증 성 조건. 이 프로토콜은 수지상 세포, 대 식 세포, 호 중구, 및 monocytes 마우스 작은 창 자와 콜론에서 같은 타고 난 면역 세포를 분리 하도 사용할 수 있습니다.

Protocol

모든 동물 실험 국립 건강 연구소의 지침에 따라 실시 하 고 스토 니 브 룩 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 했다. 주: 절차를 수행 하기 전에 모든 승인을 부여 됩니다 확인 하십시오. 1. 솔루션 준비 HGPG (HEPES, L-글루타민, 페니실린/스, 그리고 gentamycin), 100 × 혼합 59.6 g HEPES (최종 500 mM) 14.6 g L-글루타민 (200 m m 최?…

Representative Results

프로토콜의 도식 표현 묘사 된다 (그림 1). 림프 톨 유도 장 점 막 및 이펙터 사이트 내에서 명백 하 게 구성 됩니다. 파이어의 패치 (PP) 및 mesenteric 림프절 (MLN) 포함에 잘 조직 된 T 세포 및 B 세포 모 낭, 림프 톨 장 상피 세포 더 만들어진다 배포 되는 포함. Lamina propria (LP)에 브러시가 분산된 세포와 세포 고립된 림프 낭 (ILF)과 cryptopatches 같은 조직된 림…

Discussion

자세한 프로토콜 유도 (MLN와 PP) 점 막 세포는 창 자에서 격리에 대 한 제시와 이펙터 (LP 및 IEL 구획) 사이트. 프로토콜 균형 입력 (시간) 및 출력 (생존 및 수율) 결과 및 생산성을 극대화 하기 위해 개발 되었습니다. 프로토콜은 또한 LP와 IEL 구획 사이 최소 상호 compartmental 오염을 보장합니다.

마우스 소장에서 면역 세포의 고립에 대 한 여러 가지 프로토콜 되었습니다 게시<sup cl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

B.S.S.는 NIH 그랜트 (R01 AI076457)와 스토 니 브 룩 대학에서 제공 하는 자금에 의해 지원 됩니다. Z.Q.는 NIH에 의해 지원 됩니다 (K12 GM102778) 부여.

Materials

HEPES Fisher Scientific BP310-500
L-glutamine  Sigma-aldrich G3126-100G
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-122
Gentamicin Life Technologies 15710-072
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-500
RPMI 1640 Life Technologies 21870-076
Sodium bicarbonate Fisher Scientific S233-500
Fetal bovine serum Life Technologies 26140-079
10x Hanks' balanced salt solution Sigma-aldrich H4641-500ML
1,4-Dithioerythritol Sigma-aldrich D9680-5G
0.5M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575-020
Calsium chloride hexahydrate Sigma-aldrich 21108-500G
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-aldrich M2670-100G
Collagenase, Type I Life Technologies 17100-017
DG gradient stock solution (Percoll)  GE Healthcare 17-0891-01
Red Blood Cell Lysis Buffer Biolegend 420301
70-µm cell strainer  Corning 352350
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Corning 352059
Erlenmeyer flask  Kimble 26500R-50mL
Magnetic stirrer Thermo Fisher 50094596
Stir bar Fisher Scientific 14-512-148

References

  1. Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10 (3), 159-169 (2010).
  2. Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunol. 1 (1), 31-37 (2008).
  3. Lefrancois, L., Lycke, N. Isolation of mouse small intestinal intraepithelial lymphocytes, Peyer’s patch, and lamina propria cells. Curr Protoc Immunol. , 19 (2001).
  4. Sheridan, B. S., Lefrancois, L. Isolation of mouse lymphocytes from small intestine tissues. Curr Protoc Immunol. , 19 (2012).
  5. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
  6. Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. J Vis Exp. (111), (2016).
  7. Koscso, B., Bogunovic, M. Analysis and Purification of Mouse Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. 114, 11-14 (2016).
  8. Goodman, T., Lefrancois, L. Expression of the gamma-delta T-cell receptor on intestinal CD8+ intraepithelial lymphocytes. Nature. 333 (6176), 855-858 (1988).
  9. Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Beta2 integrins and ICAM-1 are involved in establishment of the intestinal mucosal T cell compartment. Immunity. 5 (3), 263-273 (1996).
  10. Sheridan, B. S., et al. gammadelta T cells exhibit multifunctional and protective memory in intestinal tissues. Immunity. 39 (1), 184-195 (2013).
  11. Sheridan, B. S., et al. Oral infection drives a distinct population of intestinal resident memory CD8(+) T cells with enhanced protective function. Immunity. 40 (5), 747-757 (2014).
  12. Romagnoli, P. A., et al. Differentiation of distinct long-lived memory CD4 T cells in intestinal tissues after oral Listeria monocytogenes infection. Mucosal Immunol. 10 (2), 520-530 (2017).
  13. Houston, S. A., et al. The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct. Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).
  14. Lorenz, R. G., Newberry, R. D. Isolated lymphoid follicles can function as sites for induction of mucosal immune responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 44-57 (2004).
  15. Kim, S. K., Reed, D. S., Heath, W. R., Carbone, F., Lefrancois, L. Activation and migration of CD8 T cells in the intestinal mucosa. J Immunol. 159 (9), 4295-4306 (1997).
  16. Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Antigen-driven induction of CD11c on intestinal intraepithelial lymphocytes and CD8+ T cells in vivo. J Immunol. 154 (11), 5684-5693 (1995).
  17. Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).

Play Video

Cite This Article
Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. J. Vis. Exp. (132), e57281, doi:10.3791/57281 (2018).

View Video