Изоляция лимфоциты от мыши небольшой кишечной иммунной системы
Summary
Здесь мы описываем подробный протокол для изоляции лимфоцитов из индуктивных сайтов, включая патчи Пейера кишечнике связанных лимфоидной ткани и крылом брыжеечных лимфатических узлов и эффекторных сайтов, включая lamina propria и кишечного эпителия кишечной иммунной системы малых.
Abstract
Кишечные иммунная система играет важную роль в поддержании барьерной функции желудочно-кишечного тракта, создавая терпимая(ый) ответы на пищевые антигены и синантропных бактерий во время монтажа эффективного иммунного ответа на энтеропатогенные микробы. Кроме того стало ясно, что местные кишечного иммунитета имеет глубокое влияние на отдаленные и системного иммунитета. Таким образом важно изучить как индуцируется кишечных иммунный ответ и что итоги иммунологического ответа. Здесь описывается подробный протокол для изоляции лимфоцитов из тонкой кишки индуктивный как патчи Пейера кишечнике связанных лимфоидной ткани и крылом брыжеечных лимфатических узлов и эффекторных сайты как lamina propria и кишечного эпителия. Эта техника обеспечивает изоляцию большое количество лимфоцитов из небольших кишечных тканей с оптимальной чистоты и жизнеспособности и минимальным полигамное загрязнения в течение приемлемого времени. Технические возможности изолировать лимфоциты и другие клетки иммунной системы от кишечных тканей позволяет понимание иммунной реакции на инфекции ЖКТ, рак и воспалительные заболевания.
Introduction
Желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) имеет много складок и выступов, которые представляет крупнейший интерфейс, отделяя внутреннего тела и внешней среды. Кишечные иммунная система играет важную роль в поддержании барьерной функции желудочно-Кишечного тракта. Оно постоянно подвергается воздействию пищевых антигенов, синантропных бактерий и болезнетворных микробов. Таким образом оно должно оставаться терпимая(ый) антигенов продовольственной и синантропных бактерий при сохранении способности быстро генерировать эффективного иммунного ответа на энтеропатогенные микробы1. Кишечной иммунной системы может анатомически разделить индуктивных сайтов, где лимфоциты наивной активируются антиген представляющих клеток, перевозящих антигены из слизистой оболочки кишечника, и эффекторных сайтов, где активированных лимфоцитов оказывают конкретные эффекторные функции2. Индуктивный сайты включают организованной лимфоидных структура Пейера (PP), что обследования кишечника люмен непосредственно через действий специализированных клеток M и крылом брыжеечных регионарных лимфатических узлов (млн.). Эффектор сайтов состоят из propria пластинки (LP), который является соединительной ткани ниже базальной мембраны и кишечного эпителия, одноклеточного слоя, расположенный над базальной мембраны, содержащий интраэпителиальных лимфоцитов (IEL). Лимфоциты являются основными участниками адаптивного иммунитета, которые посредником защиту от инфекции и рака и может также способствовать иммунопатологии в воспалительных заболеваний. Это важно и весьма актуальное значение для изучения лимфоцитов в этих различных анатомических слизистой отсеков лучше понять их индукции и эффекторных функций.
Относительно простой и унифицированный протокол для изоляции лимфоцитов из этих отсеков необходима как числа следователей, изучение иммунного события, происходящие в кишечнике ускоряется. Некоторые исследовательские группы опубликовали протоколы, которые разделяют несколько аналогичных процессов для изоляции иммунные клетки от мыши малого кишечника отсеков3,4,5,6,7 . Однако есть несколько технических различий между ними в зависимости от внимания отдельным протоколом. Например с упором на изоляцию иммунные клетки от LP, один протокол рассматривается влияние различных ферментативного пищеварения на жизнеспособность клеток, клеток поверхности маркер выражения и состав изолированных иммунные клетки5. Другой протокол выделяет быстрый и воспроизводимый метод для изоляции лимфоцитов без центрифугирования плотность6. Наконец конкретные протоколы существуют также с целью изолировать мононуклеарных фагоцитов из слоев различных тканей в тонкой кишке7. Здесь представлен высокую воспроизводимость протокол, который позволяет последовательно изоляция популяций лимфоцитов из млн, PP, LP и IEL отсека тонкой кишки.
Мы сосредоточены на изоляцию высокоочищенных населения от LP и IEL отсеков, которые основном свободны от загрязнений от других кишечных отсеков. Это широко используется протокол производит высокий урожай лимфоцитов максимально чистой и жизнеспособными в течение приемлемого времени ограничения4,8,9,10,,1112. Этот протокол также обеспечивает изоляцию лимфоцитов из LP и IEL отсека с минимальными загрязнения электрованна, позволяя bona fide возможность изучить лимфоцитов в этих различных отсеках. Изолированные лимфоциты могут быть подвергнуты дальнейшей манипуляции как гранулярных анализа потока или функционального анализа. Этот протокол успешно применяется для изоляции лимфоциты от мыши тонкой кишки и толстой кишки при бактериальных инфекций, таких как Listeria monocytogenes, Salmonella typhimuriumи Yersinia pseudotuberculosis инфекций и воспалительных заболеваний таких как химико – и возбудителя индуцированной колит. Этот протокол может использоваться также для изоляции innate иммунных клеток, таких как дендритные клетки, макрофаги, нейтрофилы и моноциты из мыши тонкой кишки и толстой кишки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Подробный протокол представляется для изоляции лимфоцитов из кишечной слизистой индукционные (млн и PP) и эффектор (LP и IEL отсека) сайтов. Протокол был разработан чтобы сбалансировать ввод (время) и выходного (жизнеспособности и урожайность) для обеспечения максимальной производительно?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Б.С.Ш поддерживается гранта NIH (R01 AI076457) и средства, предоставленные Университет Стоуни-Брук. Z.Q. поддерживается NIH Грант (K12 GM102778).
Materials
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| L-glutamine | Sigma-aldrich | G3126-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-072 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 21870-076 | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
| 10x Hanks' balanced salt solution | Sigma-aldrich | H4641-500ML | |
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-aldrich | D9680-5G | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| Calsium chloride hexahydrate | Sigma-aldrich | 21108-500G | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-aldrich | M2670-100G | |
| Collagenase, Type I | Life Technologies | 17100-017 | |
| DG gradient stock solution (Percoll) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Biolegend | 420301 | |
| 70-µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Erlenmeyer flask | Kimble | 26500R-50mL | |
| Magnetic stirrer | Thermo Fisher | 50094596 | |
| Stir bar | Fisher Scientific | 14-512-148 |
References
- Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10 (3), 159-169 (2010).
- Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunol. 1 (1), 31-37 (2008).
- Lefrancois, L., Lycke, N. Isolation of mouse small intestinal intraepithelial lymphocytes, Peyer’s patch, and lamina propria cells. Curr Protoc Immunol. , 19 (2001).
- Sheridan, B. S., Lefrancois, L. Isolation of mouse lymphocytes from small intestine tissues. Curr Protoc Immunol. , 19 (2012).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. J Vis Exp. (111), (2016).
- Koscso, B., Bogunovic, M. Analysis and Purification of Mouse Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. 114, 11-14 (2016).
- Goodman, T., Lefrancois, L. Expression of the gamma-delta T-cell receptor on intestinal CD8+ intraepithelial lymphocytes. Nature. 333 (6176), 855-858 (1988).
- Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Beta2 integrins and ICAM-1 are involved in establishment of the intestinal mucosal T cell compartment. Immunity. 5 (3), 263-273 (1996).
- Sheridan, B. S., et al. gammadelta T cells exhibit multifunctional and protective memory in intestinal tissues. Immunity. 39 (1), 184-195 (2013).
- Sheridan, B. S., et al. Oral infection drives a distinct population of intestinal resident memory CD8(+) T cells with enhanced protective function. Immunity. 40 (5), 747-757 (2014).
- Romagnoli, P. A., et al. Differentiation of distinct long-lived memory CD4 T cells in intestinal tissues after oral Listeria monocytogenes infection. Mucosal Immunol. 10 (2), 520-530 (2017).
- Houston, S. A., et al. The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct. Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).
- Lorenz, R. G., Newberry, R. D. Isolated lymphoid follicles can function as sites for induction of mucosal immune responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 44-57 (2004).
- Kim, S. K., Reed, D. S., Heath, W. R., Carbone, F., Lefrancois, L. Activation and migration of CD8 T cells in the intestinal mucosa. J Immunol. 159 (9), 4295-4306 (1997).
- Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Antigen-driven induction of CD11c on intestinal intraepithelial lymphocytes and CD8+ T cells in vivo. J Immunol. 154 (11), 5684-5693 (1995).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
