לימפוציטים בידוד מן העכבר קטן המעי המערכת החיסונית
Summary
כאן נתאר פרוטוקול מפורט על הבידוד של לימפוציטים האתרים אינדוקטיבית כולל בלוטות לימפה mesenteric המנקזים ותיקונים של פייה רקמת הלימפה הקשורים הבטן, ואת האתרים אפקטור כולל את פרופריה. מוסקולריס ו אפיתל המעי של המערכת החיסונית קטנים במעיים.
Abstract
המערכת החיסונית מעיים ממלא תפקיד חיוני בשמירה על המכשול את תפקוד מערכת העיכול על ידי יצירת סובלנית התגובות אנטיגנים תזונתיים וחיידקים commensal בעת טעינת תגובות חיסוניות יעילה כדי enteropathogenic מיקרובים. בנוסף, כבר ברור כי החסינות המקומית מעיים יש השפעה עמוקה על חסינות מרוחק ומערכתית. לכן, חשוב ללמוד איך תגובה חיסונית מעיים הוא המושרה ומהי התוצאה אוטואימונית של התגובה. . הנה, פרוטוקול מפורט מתואר על הבידוד של לימפוציטים מפני מהאתרים אינדוקטיבית המעי הדק של פייה רקמת הלימפה הקשורים בטן ותיקונים בלוטות לימפה mesenteric ניקוז ואתרי אפקטור כמו פרופריה. מוסקולריס ו אפיתל המעי. שיטה זו מבטיחה בידוד של מספר גדול של לימפוציטים רקמות במעיים קטן עם טוהר האופטימלי ואת הכדאיות מינימלי זיהום compartmental לחצות בתוך אילוצי זמן מקובל. היכולת הטכנית לבודד לימפוציטים ותאים חיסוניים אחרים רקמות מעיים מאפשר את הבנת התגובות החיסונית זיהומים במערכת העיכול, סרטן ומחלות דלקתיות.
Introduction
מערכת העיכול (GI) יש הרבה קיפולים בליטות המייצג את הממשק הגדול המפריד בין הגוף הפנימיים ואת הסביבה החיצונית. המערכת החיסונית מעיים ממלא תפקיד חיוני בשמירה על הפונקציה מכשול של דרכי העיכול. הוא כל הזמן נחשף אנטיגנים תזונתיים commensal חיידקים, חיידקים פתוגניים. בתור שכזה, זה חייב להישאר סובלני כדי אנטיגנים מזון וחיידקים commensal תוך שמירה על יכולת לייצר במהירות תגובה חיסונית יעיל חיידקים enteropathogenic1. מערכת החיסון במעי יכול להיות מבחינה אנטומית מחולק אתרי אינדוקטיבית, איפה לימפוציטים נאיביים מופעלים על ידי אנטיגן הצגת תאים נושאת אנטיגנים של רירית המעי, ואתרי אפקטור, שבו מופעל לימפוציטים להפעיל ספציפי אפקטור פונקציות2. האתרים אינדוקטיבית מהווים את המבנה הלימפה מאורגן של טלאים של פייה (PP) זה סוקר לומן מעיים ישירות דרך הפעולה של תאים מיוחדים מ’, את אזורי ניקוז בלוטות לימפה mesenteric (MLN). האתרים אפקטור מורכב מוסקולריס פרופריה (LP), אשר הוא רקמת החיבור שמתחת קרום המרתף, האפיתל במעי, שכבה תא בודד הממוקם מעל קרום המרתף המכיל intraepithelial הנרתיק לימפוציטים (אישור IEL). לימפוציטים הם השחקנים המרכזיים של חסינות מסתגלת לתווך הגנה מפני זיהומים, סרטן, עשוי גם לתרום immunopathology במחלות דלקתיות. חשוב ולהבין רלוונטיות גבוהה ללמוד לימפוציטים אלה ברורים אנטומי תאי הרירית טוב יותר שלהם אינדוקציה ופונקציות אפקטור.
פרוטוקול יחסית פשוטה ואחידה על הבידוד של לימפוציטים של תאים אלה יש צורך כפי ומאיצות מספר חוקרים חקר מערכת החיסון אירועים המתרחשים במעי. מספר קבוצות המחקר פורסמו הפרוטוקולים חולקים מספר תהליכים דומים עבור בידוד תאים חיסוניים העכבר קטן תאי המעי3,4,5,6,7 . עם זאת, ישנם מספר הבדלים טכניים בין השאר בהתאם המוקד של פרוטוקול בודדים. לדוגמה, תוך התמקדות לבודד את התאים החיסוניים מ אריך הנגן, פרוטוקול אחד בוחן את ההשפעה של digestions אנזימטיות שונות על הכדאיות התא, התא סמן משטח ביטוי ההרכב של תאים חיסוניים מבודד5. פרוטוקול אחר מדגיש שיטה לשחזור מהיר עבור בידוד של לימפוציטים ללא צפיפות צנטריפוגה6. לבסוף, פרוטוקולים מסוימים קיימים גם לצורך בידוד תאי phagocytes משכבות רקמות שונות של המעי הדק7. כאן מוצג מאוד לשחזור פרוטוקול המאפשר בידוד רציפה של לימפוציטים אוכלוסיות של תא MLN, PP, LP ו אישור IEL של המעי הדק.
אנו מתמקדים בידוד אוכלוסיות נקיים במיוחד מן LP ו אישור IEL מדורים, חופשיים במידה רבה של מזהמים של תאים מעיים אחרים. זה נעשה שימוש נרחב פרוטוקול מפיק תשואה גבוהה של לימפוציטים טהור מקסימאלית בר -קיימא תוך זמן מקובל אילוצים4,8,9,10,11,12. פרוטוקול זה גם מבטיח את הבידוד של לימפוציטים מן התא LP ו אישור IEL עם זיהום compartmental לחצות מינימלי, ומאפשר הזדמנות בתום ללמוד לימפוציטים בקרונות אלה ברורים. יכול להיות נתון לימפוציטים מבודד מניפולציות נוספות כמו ניתוח תזרים cytometric או אנליזה פונקציונלית. פרוטוקול זה יושם בהצלחה את בידודה של לימפוציטים העכבר המעי הדק, המעי הגס במהלך זיהומים חיידקיים כגון ליסטריה, סלמונלה typhimurium, Yersinia pseudotuberculosis זיהומים ובתנאים דלקתיות כמו קוליטיס כימית – ו פתוגן-induced. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לבודד תאים חיסוניים מולדים כגון תאים דנדריטים, מקרופאגים, נויטרופילים ומונוציטים העכבר המעי הדק, המעי הגס.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול מפורט מוצג עבור הבידוד של לימפוציטים מן המעי הרירית אינדוקטיביים (MLN ו- PP) ואתרים אפקטור (LP ו אישור IEL תא). הפרוטוקול פותח כדי לאזן הקלט (זמן) והפלט (הכדאיות ואת התשואה) להגדיל את הפרודוקטיביות ואת תוצאות. הפרוטוקול מבטיח גם זיהום compartmental לחצות מינימלי בין תאים LP ו אישור IEL.
<p class="jove_co…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
B.S.S. נתמך על ידי מענק-NIH (R01 AI076457) וקרנות הניתנים על ידי האוניברסיטה בסטוני ברוק. Z.Q. נתמך על-ידי NIH הענק (K12 GM102778).
Materials
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| L-glutamine | Sigma-aldrich | G3126-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-072 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 21870-076 | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
| 10x Hanks' balanced salt solution | Sigma-aldrich | H4641-500ML | |
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-aldrich | D9680-5G | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| Calsium chloride hexahydrate | Sigma-aldrich | 21108-500G | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-aldrich | M2670-100G | |
| Collagenase, Type I | Life Technologies | 17100-017 | |
| DG gradient stock solution (Percoll) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Biolegend | 420301 | |
| 70-µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Erlenmeyer flask | Kimble | 26500R-50mL | |
| Magnetic stirrer | Thermo Fisher | 50094596 | |
| Stir bar | Fisher Scientific | 14-512-148 |
References
- Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10 (3), 159-169 (2010).
- Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunol. 1 (1), 31-37 (2008).
- Lefrancois, L., Lycke, N. Isolation of mouse small intestinal intraepithelial lymphocytes, Peyer’s patch, and lamina propria cells. Curr Protoc Immunol. , 19 (2001).
- Sheridan, B. S., Lefrancois, L. Isolation of mouse lymphocytes from small intestine tissues. Curr Protoc Immunol. , 19 (2012).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. J Vis Exp. (111), (2016).
- Koscso, B., Bogunovic, M. Analysis and Purification of Mouse Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. 114, 11-14 (2016).
- Goodman, T., Lefrancois, L. Expression of the gamma-delta T-cell receptor on intestinal CD8+ intraepithelial lymphocytes. Nature. 333 (6176), 855-858 (1988).
- Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Beta2 integrins and ICAM-1 are involved in establishment of the intestinal mucosal T cell compartment. Immunity. 5 (3), 263-273 (1996).
- Sheridan, B. S., et al. gammadelta T cells exhibit multifunctional and protective memory in intestinal tissues. Immunity. 39 (1), 184-195 (2013).
- Sheridan, B. S., et al. Oral infection drives a distinct population of intestinal resident memory CD8(+) T cells with enhanced protective function. Immunity. 40 (5), 747-757 (2014).
- Romagnoli, P. A., et al. Differentiation of distinct long-lived memory CD4 T cells in intestinal tissues after oral Listeria monocytogenes infection. Mucosal Immunol. 10 (2), 520-530 (2017).
- Houston, S. A., et al. The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct. Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).
- Lorenz, R. G., Newberry, R. D. Isolated lymphoid follicles can function as sites for induction of mucosal immune responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 44-57 (2004).
- Kim, S. K., Reed, D. S., Heath, W. R., Carbone, F., Lefrancois, L. Activation and migration of CD8 T cells in the intestinal mucosa. J Immunol. 159 (9), 4295-4306 (1997).
- Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Antigen-driven induction of CD11c on intestinal intraepithelial lymphocytes and CD8+ T cells in vivo. J Immunol. 154 (11), 5684-5693 (1995).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
