マウス小腸管免疫系からリンパ球を分離すること
Summary
腸管関連リンパ組織パイエル排水腸間膜リンパ節など誘導サイトと粘膜を含むエフェクター サイトからのリンパ球の隔離のための詳しいプロトコルについて述べると、小さな腸管免疫系の腸上皮は。
Abstract
腸管の免疫系は、急性胃腸炎起因する効果的な免疫応答をマウントしながらレスポンス食物抗原と共生細菌の耐性を生成することによって、腸管のバリア機能を維持する上で重要な役割を果たしています。微生物。さらに、ローカルの腸管免疫では、遠いと全身の免疫力の深遠な影響が明らかになった。そのため、腸内の免疫応答を誘導する方法と、免疫応答の結果を研究することが重要です。腸管関連リンパ組織パイエルとドレインの腸間膜リンパ節のような小腸誘導サイトと粘膜のようなエフェクター サイトからのリンパ球の隔離のための詳しいプロトコルの説明ここと腸上皮。この手法は、最適な純度と生存率と許容可能な時間制約の中での最低限のコンパートメント クロスコンタミネーション多数小さい腸組織からのリンパ球の分離を保証します。リンパ球および小腸組織から他の免疫細胞を分離する技術力により、消化器感染症、癌、炎症性疾患に対する免疫応答の理解。
Introduction
胃腸 (GI) 地域には多くのひだや突起内部の体と外部環境を分離する最大のインターフェイスを表す。腸管の免疫系は、消化管のバリア機能を維持する上で重要な役割を果たしています。それは常に食物抗原、共生細菌と病原微生物にさらされます。そのため、それは急速に急性胃腸炎起因微生物1効果的な免疫応答を生成する能力を維持しながらの食物抗原と共生細菌への耐性に残らなければなりません。腸管免疫系誘導サイト、ナイーブ リンパ球は抗原提示細胞が腸の粘膜から抗原を運ぶがアクティブ化されている、およびエフェクター サイト、活性化リンパ球出す特定に解剖学的分類できます。エフェクター機能2。誘導サイトは、調査専門の M 細胞と地域の排水腸間膜リンパ節 (MLN) の作用により直接腸管パイエル板 (PP) のリンパ組織構造を構成します。エフェクター サイトは基底膜と小腸上皮、上皮間リンパ球 (IEL) を含む基底膜上にある単一の細胞層の下の結合組織である粘膜 (LP) から成っています。リンパ球が、感染症や癌に対する保護を仲介し、炎症性疾患の免疫病理学にまた貢献するかもしれない適応免疫の主要なプレーヤーです。それは重要でありこれらの明瞭なリンパ球の研究に関連性の高いより良い粘膜局所理解の誘導とエフェクター機能。
腸内免疫事象を探る捜査官の数を加速するいると、これらのコンパートメントからのリンパ球の隔離のための比較的シンプルで統一されたプロトコルが必要です。いくつかの研究グループがマウス小さい腸内コンパートメント3,4,5,6,7 から免疫細胞を分離することにいくつかの類似のプロセスを共有プロトコルを公開しています。.ただし、個々 のプロトコルの焦点に応じてそれらの間でいくつかの技術的な違いがあります。たとえば、LP から免疫細胞を孤立させることにフォーカスを 1 つのプロトコルは細胞生存率、細胞表面マーカーの発現と分離免疫細胞5の構成に関するさまざまな酵素の消化力の影響を調べます。他のプロトコルは、密度遠心分離6なくリンパ球の隔離のための迅速かつ再現性のある方法を強調表示します。最後に、特定のプロトコルは、小腸7の異なったティッシュ層から単核食細胞を分離する目的も存在します。ここでは、小腸の MLN PP LP、IEL のコンパートメントからリンパ球集団の連続分離ができる再現性の高いプロトコルが表示されます。
我々 は主無料その他の腸の仕切りからの汚染物質の LP と IEL のコンパートメントから高純度の人口を隔離するのに焦点を当てます。これは広くプロトコル生成に許容可能な時間の制約4,8,9,10、11,12内で最大限に純粋な実行可能なリンパ球の高収率を使用しました。このプロトコルはまたこれらの異なるコンパートメントにリンパ球を勉強する善意の機会をできるように最小限の交差コンパートメント汚染と LP と IEL コンパートメントからのリンパ球の分離を保証します。分離されたリンパ球は、フローサイトメトリーによる解析や機能解析のようなそれ以上の操作を受けることができます。このプロトコルが正常にリンパ球の分離にマウス小腸と大腸から中に適用されたリステリア菌、サルモネラ、エルシニア ペスチスなど細菌感染症感染症や化学物質、病原体誘発大腸炎などの炎症性条件。このプロトコルは、樹状細胞、マクロファージ、好中球と単球マウス小腸結腸からなどの自然免疫系細胞を分離するも使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
誘導 (MLN と PP)、腸内から粘膜のリンパ球の隔離のため詳細なプロトコルを提示とエフェクター (LP、IEL コンパートメント) サイト。プロトコルが (時間) の入力と出力 (生存率と収量) の生産性と成果を最大化するバランスを開発しました。プロトコルはまた LP と IEL のコンパートメント間の最小限のコンパートメント クロスコンタミネーションを保証します。
マウス小腸…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
B.S.S. をサポートするには、NIH グラント (R01 AI076457) とストーニブ ルック大学によって提供される資金。Z.q 値は NIH 支え (K12 GM102778) を付与します。
Materials
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| L-glutamine | Sigma-aldrich | G3126-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-072 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 21870-076 | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
| 10x Hanks' balanced salt solution | Sigma-aldrich | H4641-500ML | |
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-aldrich | D9680-5G | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| Calsium chloride hexahydrate | Sigma-aldrich | 21108-500G | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-aldrich | M2670-100G | |
| Collagenase, Type I | Life Technologies | 17100-017 | |
| DG gradient stock solution (Percoll) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Biolegend | 420301 | |
| 70-µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Erlenmeyer flask | Kimble | 26500R-50mL | |
| Magnetic stirrer | Thermo Fisher | 50094596 | |
| Stir bar | Fisher Scientific | 14-512-148 |
References
- Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10 (3), 159-169 (2010).
- Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunol. 1 (1), 31-37 (2008).
- Lefrancois, L., Lycke, N. Isolation of mouse small intestinal intraepithelial lymphocytes, Peyer’s patch, and lamina propria cells. Curr Protoc Immunol. , 19 (2001).
- Sheridan, B. S., Lefrancois, L. Isolation of mouse lymphocytes from small intestine tissues. Curr Protoc Immunol. , 19 (2012).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. J Vis Exp. (111), (2016).
- Koscso, B., Bogunovic, M. Analysis and Purification of Mouse Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. 114, 11-14 (2016).
- Goodman, T., Lefrancois, L. Expression of the gamma-delta T-cell receptor on intestinal CD8+ intraepithelial lymphocytes. Nature. 333 (6176), 855-858 (1988).
- Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Beta2 integrins and ICAM-1 are involved in establishment of the intestinal mucosal T cell compartment. Immunity. 5 (3), 263-273 (1996).
- Sheridan, B. S., et al. gammadelta T cells exhibit multifunctional and protective memory in intestinal tissues. Immunity. 39 (1), 184-195 (2013).
- Sheridan, B. S., et al. Oral infection drives a distinct population of intestinal resident memory CD8(+) T cells with enhanced protective function. Immunity. 40 (5), 747-757 (2014).
- Romagnoli, P. A., et al. Differentiation of distinct long-lived memory CD4 T cells in intestinal tissues after oral Listeria monocytogenes infection. Mucosal Immunol. 10 (2), 520-530 (2017).
- Houston, S. A., et al. The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct. Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).
- Lorenz, R. G., Newberry, R. D. Isolated lymphoid follicles can function as sites for induction of mucosal immune responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 44-57 (2004).
- Kim, S. K., Reed, D. S., Heath, W. R., Carbone, F., Lefrancois, L. Activation and migration of CD8 T cells in the intestinal mucosa. J Immunol. 159 (9), 4295-4306 (1997).
- Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Antigen-driven induction of CD11c on intestinal intraepithelial lymphocytes and CD8+ T cells in vivo. J Immunol. 154 (11), 5684-5693 (1995).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
