Um sistema de Microbiomechanical para estudar a formação de varizes e a recuperação no axônio do neurônio Central

Formação de varizes ou inchaço/perolização, ao longo do axônio, é uma característica proeminente de neurodegeneração observada em muitos distúrbios ou lesões do sistema nervoso central, incluindo esclerose múltipla, doença de Alzheimer, doença de Parkinson e traumáticas ^1,de lesão cerebral². Apesar dos impactos fisiológicos significativos de varicosidades axonal na propagação do potencial de ação e transmissão sináptica³, como as varizes são geradas permanece desconhecida. Recentemente, usando um ensaio microbiomechanical recém-criada em neurônios hippocampal culturas de roedores, descobrimos que estímulos mecânicos podem induzir as varizes nestes neurônios com altamente intrigante características. Em primeiro lugar, a indução de varizes é rápida (< 10 s) e este processo é reversível inesperadamente. Em segundo lugar, a iniciação de varizes depende da força de pressão de sopro: quanto maior a pressão, mais rápido a iniciação. Em terceiro lugar, iniciação de varizes depende de idade neuronal. Os axônios dos neurônios jovens aparecem mais sensíveis ao estresse mecânico, comparado dos neurônios mais velhos. Em quarto lugar, a forma das varizes ao longo dos axônios dos neurônios hippocampal, enquanto as dendrites e segmentos do axônio inicial destes neurônios não exibir nenhuma mudança sob a mesma condição de sopro. Assim, nosso estudo revelou uma característica nova da polaridade neuronal. Esses achados com o sistema in vitro são fisiologicamente relevantes. Usando um modelo in vivo para leve traumatismo crânio-encefálico (mTBI), mostramos que as varizes axonal desenvolveram de forma multi focal no córtex somatossensorial dos ratos imediatamente após fechar-crânio impacto, consistente com o nosso em vitro resultados⁴. É importante notar que nossa coloração e da imagem latente dos ratos mTBI fornecem apenas um snap shot de alterações morfológicas neuronais, desde executar na vivo imagem de lapso de tempo da morfologia neuronal durante um impacto mecânico é ainda não é viável.

Este sistema de fluido-sopro nos permitiu não só para capturar características únicas associadas com a formação de varizes induzida por estresse mecânico, mas também para determinar o mecanismo subjacente. Ao testar diferentes soluções extracelulares, os bloqueadores e abridores de candidatos diferentes de canais de íon mechanosensitive e Eletrofisiologia celular, identificamos que o cátion potencial transiente do receptor canal membro da subfamília V 4 (TRPV4) canal permeável ao Ca^{2 +} e at⁺ e ativada pelo sopro é principalmente responsável pela detecção de estresse mecânico inicial durante a formação de varizes axonal⁴. Isto foi confirmado ainda mais com uma abordagem de nocaute de siRNA. Tomados em conjunto, este novo sistema de ensaio, que temos desenvolvido com cultura de neurônio hippocampal, é altamente valiosa para estudar as propriedades micromecânicas de neurônios centrais, especialmente em combinação com outras técnicas.

Este sistema Micromecânico estabelecemos é único e difere dos sistemas existentes anteriormente em vários aspectos importantes. Em primeiro lugar, neste sistema, os neurônios experimentam fora-do-avião estresse mecânico nas formas de compressão e cisalhamento. Durante o impacto mecânico, processos neuronais ficar aderente à superfície da lamela e não se mexa. Isto difere de outros sistemas que envolveu principalmente flexão e alongamento no plano experimental (ou tensão), por exemplo, a deflexão de axônios empacotados como movendo sequências de caracteres de^5,6 ou alongamento axônios cultivados em micropatterned canais e membranas stretchable^7,8. Além disso, embora as varizes axonal podem também ser induzidas nestes ensaios como no nosso sistema de fluido-sopro, o processo nessas configurações leva muito mais tempo (a partir de 10 min para várias horas^6,7,8) e aparece irreversível. Finalmente, o nosso sistema usando o sopro fluido local permite o exame das características espaciais da formação de varizes (EG., dendrites, espinhas dendríticas, soma, segmentos iniciais axonal, terminais axonal), além de suas características temporais. Usando este sistema, descobrimos vários recursos inesperados e exclusivos de formação de varizes axonal, especialmente rápido início lenta reversibilidade e polaridade do axônio-dendrito.

O sistema que discutimos neste trabalho é compatível com muitas técnicas de molecular e biologia da pilha. Por exemplo, para estudar os efeitos do estresse mecânico na morfologia neuronal e função, pode ser usada em conjunto com coculture de mielina, lapso de tempo por imagem da transferência de energia de ressonância fluorescente (FRET) e reflexão interna total da fluorescência (TIRF), imagem de cálcio e gravação de braçadeira do remendo. Neste trabalho, focalizamos os componentes do núcleo do sistema. Cultura de neurônio hippocampal, o fluido-sopro de instalação, de alta resolução de imagem de lapso de tempo para o transporte axonal e imagem de cálcio são ilustradas passo a passo abaixo.