نظام ميكروبيوميتشانيكال لدراسة تشكيل فاريكوسيتي والانتعاش في محاور عصبية من الخلايا العصبية المركزية

تشكيل فاريكوسيتي، أو تورم/الديكور، على طول محاور عصبية، سمة بارزة من نيوروديجينيريشن التي لوحظت في العديد من الاضطرابات أو إصابات الجهاز العصبي المركزي، بما في ذلك التصلب المتعدد، مرض الزهايمر، مرض باركنسون، والصدمات الدماغ إصابة^1،2. وعلى الرغم من الآثار الفسيولوجية ل varicosities محواري في نشر إمكانيات العمل وانتقال متشابك³، كيف يتم إنشاؤها في فاريكوسيتيس لا يزال غير معروف. في الآونة الأخيرة، استخدام الإنزيم ميكروبيوميتشانيكال المنشأة حديثا في الخلايا العصبية هيبوكامبال مثقف من القوارض، وجدنا أن المنبهات الميكانيكية يمكن أن تحدث فاريكوسيتيس في هذه الخلايا العصبية مع فضول ميزات عالية. أولاً، تحريض فاريكوسيتي السريع (< 10 ق) وهذه العملية لا يمكن عكسها بشكل غير متوقع. ثانيا، الشروع في فاريكوسيتي تعتمد على قوة ضغط النفخ: ارتفاع الضغط، والبدء بشكل أسرع. ثالثا، بدء فاريكوسيتي يعتمد على سن الخلايا العصبية. محاور عصبية من الخلايا العصبية الأصغر سنا تظهر أكثر استجابة للضغوط الميكانيكية، مقارنة بتلك الخلايا العصبية القديمة. رابعا، عرض النموذج فاريكوسيتيس على طول محاور عصبية الخلايا العصبية هيبوكامبال، بينما dendrites وشرائح إكسون الأولية من هذه الخلايا العصبية لا تغيير تحت نفس الشرط النفخ. وهكذا كشفت دراستنا سمة رواية من الأقطاب العصبية. هذه النتائج مع النظام في المختبر الناحية الفسيولوجية ذات الصلة. استخدام نموذج في فيفو لإصابات الدماغ الرضية خفيفة (mTBI)، واظهرنا أن varicosities محواري المتقدمة بطريقة تنسيق متعددة في قشرة somatosensory الفئران فورا بعد إغلاق الجمجمة أثر، اتساقا مع جهودنا في المختبر ⁴من النتائج. من المهم أن نلاحظ أن لدينا المصبوغة والتصوير من الفئران متبي توفر فقط رصاصة المفاجئة من التغييرات الشكلية العصبية، منذ أداء في فيفو الوقت الفاصل بين التصوير مورفولوجيا الخلايا العصبية خلال تأثير ميكانيكية لا تزال غير مجدية.

هذا نظام النفخ السائل أتاح لنا ليس فقط لالتقاط السمات الفريدة المرتبطة بتشكيل فاريكوسيتي الميكانيكية الناجمة عن الإجهاد، ولكن أيضا لتحديد الآلية الأساسية. عن طريق اختبار مختلف الحلول خارج الخلية، محصرات وفتاحات المرشحين مختلف قنوات أيون ميتشانوسينسيتيفي، والكهربية الخلوية، حددنا أن القناة الموجبة المحتملة عابر مستقبلات الفصيلية V الأعضاء 4 (TRPV4) القناة التي يسهل اختراقها إلى Ca^{2 +} و Na⁺ وتنشيطه بواسطة النفخ المسؤولة أساسا عن الكشف عن الإجهاد الميكانيكية الأولى أثناء تشكيل محواري فاريكوسيتي⁴. وأكد كذلك مع نهج siRNA خروج المغلوب. أخذت معا، هذا النظام الجديد للمقايسة وقد وضعنا مع ثقافة العصبية هيبوكامبال، هو قيمة للغاية لدراسة خصائص ذبابة الخلايا العصبية المركزية، لا سيما في تركيبة مع تقنيات أخرى.

هذا النظام ذبابة أنشأنا فريد من نوعه ويختلف عن النظم الموجودة سابقا في عدة جوانب رئيسية. أولاً، تجربة الخلايا العصبية في هذا النظام، الخروج من الطائرة الإجهاد الميكانيكية في أشكال الضغط والقص. خلال تأثير الميكانيكية، لا تزال تعلق على السطح ساترة العمليات العصبية ولا تتحرك. وهذا يختلف عن سائر نظم تنطوي أساسا على الانحناء وتمتد في الطائرة التجريبية (أو التوتر)، على سبيل المثال، مثل الانحراف من محاور عصبية المجمعة نقل سلاسل^5،6 أو تمتد محاور عصبية نمت في ميكروباتيرنيد القنوات والأغشية المط^7،8. وعلاوة على ذلك، على الرغم من أن varicosities محواري يمكن أن يتسبب أيضا في هذه الاختبارات مثل في نظامنا النفخ السائل، بعملية في هذه الإعدادات يأخذ وقتاً أطول بكثير (من 10 دقيقة إلى عدة ساعات^6،،من⁷⁸) ويظهر لا رجعة فيه. وأخيراً، يسمح نظامنا استخدام النفخ السوائل المحلية دراسة السمات المكانية لتشكيل فاريكوسيتي (مثلاً.، dendrites، العمود الفقري الجذعية، سوما، الأجزاء الأولى محواري، محطات محواري)، إلى جانب ميزاته الزمانية. باستخدام هذا النظام، فقد اكتشفنا عدة غير متوقعة وفريدة من نوعها ميزات تكوين محواري فاريكوسيتي، وبخاصة السريعة الحدوث، وعكس بطيئة، وقطبية إكسون-تغصن.

النظام أن نناقش في هذه الورقة متوافق مع العديد من تقنيات جزيئية وخلية علم الأحياء. على سبيل المثال، لدراسة آثار الإجهاد الميكانيكي على مورفولوجيا الخلايا العصبية ودالة، يمكن استخدامه جنبا إلى جنب مع كوكولتوري المايلين، الوقت الفاصل بين التصوير الرنين الفلورسنت نقل الطاقة (الحنق) وانعكاس الداخلية مجموع الأسفار (TIRF)، تصوير الكالسيوم، وتسجيل المشبك التصحيح. في هذه الورقة، ونحن نركز على العناصر الأساسية للنظام. ثقافة العصبية هيبوكامبال والإعداد النفخ السائل، وتصوير مرور الزمن ذات الدقة العالية للنقل محواري وتصوير الكالسيوم موضحة خطوة بخطوة أدناه.