Ein Microbiomechanical-System für das Studium Varizen-Bildung und Erholung in zentralen Neuronen Axone

Varizen-Bildung oder Schwellung/Sicke, entlang der Axone, ist ein hervorstechendes Merkmal der Neurodegeneration bei vielen Erkrankungen oder Verletzungen des zentralen Nervensystems, einschließlich multipler Sklerose, Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson, beobachtet und traumatischen Gehirn Verletzungen^1,2. Trotz der erheblichen physiologischen Auswirkungen der axonalen Krampfadern auf Aktionspotential Ausbreitung und die synaptische Übertragung³wie die Krampfadern entstehen, bleibt unbekannt. Vor kurzem, mit einer neu gegründeten Microbiomechanical-Assay auf kultivierten hippocampal Neuronen von Nagetieren, fanden wir, dass mechanische Reize Krampfadern in diesen Neuronen mit höchst faszinierende Funktionen hervorrufen können. Erstens Varizen Induktion ist schnell (< 10 s) und dieser Prozess kann unerwartet rückgängig gemacht werden. Zweitens, Varizen Einleitung hängt von der Stärke schnaufend Druck: je höher der Druck, desto schneller die Einleitung. Varizen Einleitung hängt Drittens neuronalen Alter. Die Axone der jüngere Neuronen scheinen stärker auf die mechanische Beanspruchung im Vergleich zu älteren Neuronen. Vierter, Krampfadern Form entlang der Axone hippocampal Neuronen, während die Dendriten und erste Axon Segmente dieser Neuronen zeigen keine Veränderung unter den gleichen Bedingungen, puffing. So, unsere Studie ergab ein Novum der neuronale Polarität. Diese Erkenntnisse mit dem in-vitro- System sind physiologisch relevanten. Eine in Vivo Modell zeigten für milde traumatische Hirnverletzungen (mTBI) wir, dass axonale Krampfadern in einer Multi-focal Mode im somatosensorischen Cortex der Mäuse, sofort nach dem Schließen-Totenkopf Aufprall, Einklang mit unserem in-vitro entwickelt- Ergebnisse⁴. Es ist wichtig zu beachten, dass unsere Färbung und Bildgebung der mTBI Mäuse nur eine Momentaufnahme der neuronalen morphologische Veränderungen, seit Durchführung in Vivo Zeitraffer Bildgebung der neuronale Morphologie während eine mechanische Wirkung ist noch nicht möglich.

Diese Flüssigkeit schnaufend System erlaubt uns nicht nur einzigartige Eigenschaften zu mechanischen Stress-induzierte Varizen-Bildung zu erfassen, sondern auch den zugrunde liegende Mechanismus zu bestimmen. Durch das Testen verschiedener extrazellulären Lösungen, Blocker und Öffner der verschiedenen Kandidaten der Mechanosensitive Ionenkanäle und zelluläre Elektrophysiologie, festgestellt wir, dass die Transienten Rezeptor potenzielle kation Kanal Unterfamilie V Bauteil 4 (TRPV4) Kanal, der ist durchlässig für Ca^{2 +} und Na⁺ und aktiviert durch schnaufend ist hauptverantwortlich für die erste mechanischen Beanspruchung während der axonalen Varizen Bildung⁴erkennen. Dies wurde noch mit einem SiRNA ko Ansatz bestätigt. Zusammengenommen, diesem neuen Testsystem, die wir mit hippocampal Neuronen Kultur entwickelt haben, ist sehr wertvoll für die Mikromechanische Eigenschaften des zentralen Neuronen, vor allem in Kombination mit anderen Techniken zu studieren.

Dieses mikromechanische System, die, das wir eingerichtet haben, ist einzigartig und unterscheidet sich von den bereits bestehenden Systemen in einigen wichtigen Aspekten. Zuerst erleben die Neuronen in diesem System Out-of-Plane mechanischen Beanspruchung in den Formen der Kompression und Scheren. Während die mechanischen Auswirkungen neuronale Prozesse bleiben an der Oberfläche Deckglas und bewegen sich nicht. Dies unterscheidet sich von anderen experimentellen Systemen, die vor allem bücken und Strecken in der Ebene beteiligt (oder Spannung), zum Beispiel die Durchbiegung der gebündelte Axone wie Saiten^5,6 verschieben oder dehnen Axone auf Micropatterned gewachsen Kanäle und dehnbare Membranen^7,8. Darüber hinaus obwohl axonale Krampfadern auch in induziert werden können diese Tests wie in unserem Flüssigkeit schnaufend System, den Prozess in diesen Einstellungen dauert viel länger (ab 10 min bis mehreren Stunden^6,7,8) und erscheint irreversible. Zu guter Letzt unser System mit lokalen Fluid schnaufend ermöglicht die Untersuchung der räumlichen Eigenschaften der Varizen-Bildung (zB., Dendriten, dendritische Dornen, Soma, axonalen ersten Segmente axonalen Klemmen), neben seiner zeitlichen Eigenschaften. Mit diesem System haben wir mehrere unerwartete und einzigartige Eigenschaften der axonalen Varizen-Bildung, vor allem schnellen Wirkungseintritt langsam Reversibilität und Axon-Dendrit Polarität entdeckt.

Das System, das wir in diesem Papier zu diskutieren ist kompatibel mit vielen Techniken der molekularen und Zellbiologie. Zum Beispiel zur Untersuchung der Auswirkungen von mechanischem Stress auf neuronale Morphologie und Funktion zusammen mit Myelin Coculture, Time-Lapse Bildgebung des Fluoreszenz Resonanz Energietransfer (FRET) und Totalreflexion Fluoreszenz (TIRF) einsetzbar Calcium Imaging und Patch-Clamp-Aufnahme. In diesem Artikel konzentrieren wir uns auf den Kern-Komponenten des Systems. Hippocampal Neuronen Kultur, die Flüssigkeit schnaufend Setup, hochauflösender Zeitraffer Imaging für axonalen Transport und Kalzium Imaging werden Schritt für Schritt unten illustriert.